遺伝子部位特異的なプロテオミクスによる急性骨髄性白血病細胞のクロマチン動態解析

ヒストンアセチル化酵素であるKAT7は、MLL遺伝子座の転移によって引き起こされる急性骨髄性白血病細胞の増殖に必須な遺伝子であることが当研究室で明らかにされた。KAT7はMLL融合タンパク質のターゲット遺伝子の発現制御に寄与することがわかっているが、その具体的な分子機構については未だ不明な点が多い。本研究では、CRISPR技術と近位標識技術を組み合わせた部位特異的なプロテオミクス手法を確立し、KAT7が寄与する遺伝子制御機構を明らかにすることを目的としている。昨年度の研究では、任意の領域をビオチン化することに成功していたがその効率は低く、単一領域のプロテオミクスを行うレベルには至らなかった。したがって当該年度では、さらなる条件検討と実験手法の改良が必要であった。そこで、効率良くビオチン化を行う手法の検討のために、マウス胎児線維芽細胞を用いて様々な条件検討を行った。その結果、ホルマリン固定後にビオチン化反応を行うことで、質量分析によってターゲット領域のタンパク質を同定することが可能になった。しかしながら、改良した手法でもAML細胞株を用いた単一領域のプロテオミクスを行うことはできなかった。これまで、近位標識技術には、APEX法を用いていたが、現在、異なる手法であるBioID技術を用いた手法について検証を行なっており、APEX法より高効率でビオチン化されることを確認している。また異なるアプローチとして、MLL融合タンパク質にビオチンラベリングドメインを付加し、MLL融合タンパク質の相互作用因子を解析する手法の確立を試みている。

ヒストンアセチル化酵素であるKAT7は、MLL遺伝子座の転移によって引き起こされる急性骨髄性白血病細胞の増殖に必須な遺伝子であることが当研究室で明らかにされた。KAT7はMLL融合タンパク質のターゲット遺伝子の発現制御に寄与することがわかっているが、その具体的な分子機構については未だ不明な点が多い。本研究では、CRISPR技術と近位標識技術を組み合わせた部位特異的なプロテオミクス手法を確立し、KAT7が寄与する遺伝子制御機構を明らかにすることを目的としている。昨年度の研究では、任意の領域をビオチン化することに成功していたがその効率は低く、単一領域のプロテオミクスを行うレベルには至らなかった。したがって当該年度では、さらなる条件検討と実験手法の改良が必要であった。そこで、効率良くビオチン化を行う手法の検討のために、マウス胎児線維芽細胞を用いて様々な条件検討を行った。その結果、ホルマリン固定後にビオチン化反応を行うことで、質量分析によってターゲット領域のタンパク質を同定することが可能になった。しかしながら、改良した手法でもAML細胞株を用いた単一領域のプロテオミクスを行うことはできなかった。これまで、近位標識技術には、APEX法を用いていたが、現在、異なる手法であるBioID技術を用いた手法について検証を行なっており、APEX法より高効率でビオチン化されることを確認している。また異なるアプローチとして、MLL融合タンパク質にビオチンラベリングドメインを付加し、MLL融合タンパク質の相互作用因子を解析する手法の確立を試みている。