細菌の形質転換に関わる核酸輸送体の分子メカニズムの解明

阐明核酸转运蛋白参与细菌转化的分子机制

• 批准号: 21K15027
• 负责人: 平野 央人
• 金额: $ 3万
• 依托单位: The University of Tokyo
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
• 财政年份: 2021
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2021-04-01 至 2024-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-21K15027/
• 关键词: 構造生物学; 形質転換

精製可能な複数の生物種のComECを用いて、クライオ電子顕微鏡を用いた単粒子解析を行った。これまでの経験から、膜タンパク質のクライオ電子顕微鏡を用いた単粒子解析では、最終精製産物のバッファー条件（特に界面活性剤の種類）、氷包埋法の際に試料を乗せるグリッドの種類やグリッドへの添加物（ペンチルアミン等）によって大きく成否が左右される。そこで、これらの条件検討を行った結果、コントラストが明瞭なComECの電子顕微鏡像が得られる条件を特定した。この条件において、クライオ電子顕微鏡（Titan Krios）によって4000枚の画像を撮影し、単粒子構造解析ソフトウェアCryoSPARCにて処理した結果、6-7Å程度の密度マップを取得することに成功した。これら一連の構造解析から、ComECのコントラストが明瞭な画像が得られれば、ComECは小さいタンパク質で特徴量が少ないながらも粒子のアラインメントを合わせ、二次元平均画像および三次元密度マップを得ることは可能であることが明らかとなった。一方で、高分解能の構造情報が得られていないのは膜貫通領域そのもの、および、膜貫通領域と膜外ドメインとの相対的な位置関係などに不均一性があることが原因であると示唆された。一方で、構造解析と同時並行でComECによるDNA切断実験を行った。精製した野生型ComECに対して、様々な箇所にPhosphorothioateを導入したDNAを反応させ、その切断パターンを確認した。結果として、ComECは二本鎖DNA、一本鎖DNAの両方を基質とするエンドヌクレアーゼであること明らかとなった。

Comec for purification of multiple biological species is used for particle analysis. This is the case for the analysis of single particles in the use of electron microscope, the final purification conditions (special surfactant species), the sample species and additives (special surfactant species, etc.) in the case of embedding method, and the determination of large amounts of impurities. The results of this study indicate that the electronic micro-image of ComEC can be obtained under certain conditions. These conditions were met by Titan Krios, a 4000-pixel image was extracted, and the particle structure was analyzed by CryoSPARC. The results were obtained successfully with a density of 6-7 μ m. ComEC is composed of a series of structural analysis, a series of qualitative characteristics, a series of two-dimensional average images, and a series of three-dimensional density characteristics. The structural information of high resolution energy is obtained from the position relationship between the film penetration area and the film penetration area. One side, structural analysis and parallel to ComEC, DNA cleavage is carried out Refined wild-type Comec is introduced into the DNA, and the DNA is isolated. As a result, it is clear that ComEC will not be able to use the two basic DNA and one basic DNA as the basis for its development.