ＲＮＡ編集に関わる超分子複合体の構造解析

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本研究員はキネトプラスト類のミトコンドリアで行われるガイドRNA依存的なRNA編集の分子機構の解明のために、ガイドRNA結合に関わる超分子複合体MRB1のサブ複合体の中で、ガイドRNAと標的RNAの結合に関わる複合体GRBCの構造解析に取り組んできた。本研究ではGRBC複合体を精製し、ガイドRNAとターゲットRNAを加えたのちにゲルろ過クロマトグラフィーを行うことによってGRBC-ガイドRNA-ターゲットRNA三者複合体を再構成し、クライオ電子顕微鏡を用いた単粒子解析を行うことによって構造解析を目指している。そのためにはGRBCタンパク質を細胞内で大量発現させ、高純度に精製する必要があり、本年度は発現系の構築を中心に研究を進めた。GRBCは7つのタンパク質(GRBC1-7)からなる複合体である。タンパク質の安定性向上のために、GRBC1-7のそれぞれにおいてN末端またはC末端領域に存在するディスオーダー領域を欠損させることを検討した。また、可溶性向上のために、GRBC1-7それぞれのN末端にSUMOタンパク質を付加した状態でpETベクターへクローニングし、IPTGを用いた発現誘導により大腸菌内におけるタンパク質の発現を検討した。SUMOタンパク質と目的タンパク質の間にはタグ切断のためにTEVプロテアーゼ認識配列を付加した。また、ニッケルアフィニティークロマトグラフィーのためのヒスチジンタグの位置を検討した結果、それぞれN末端にタグを付加するのが最適であることが明らかになった。