ＲＮＡ編集に関わる超分子複合体の構造解析

RNA编辑中涉及的超分子复合物的结构分析

• 批准号: 17J06162
• 负责人: 平野 央人
• 金额: $ 1.98万
• 依托单位: The University of Tokyo
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2017
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2017-04-26 至 2020-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-17J06162/
• 关键词: RNA編集; GRBC; 構造生物学; CRISPR-Cas; 結晶化; X線結晶構造解析

本研究員はキネトプラスト類のミトコンドリアで行われるガイドRNA依存的なRNA編集の分子機構の解明のために、ガイドRNA結合に関わる超分子複合体MRB1のサブ複合体の中で、ガイドRNAと標的RNAの結合に関わる複合体GRBCの構造解析に取り組んできた。本研究ではGRBC複合体を精製し、ガイドRNAとターゲットRNAを加えたのちにゲルろ過クロマトグラフィーを行うことによってGRBC-ガイドRNA-ターゲットRNA三者複合体を再構成し、クライオ電子顕微鏡を用いた単粒子解析を行うことによって構造解析を目指している。そのためにはGRBCタンパク質を細胞内で大量発現させ、高純度に精製する必要があり、本年度は発現系の構築を中心に研究を進めた。GRBCは7つのタンパク質(GRBC1-7)からなる複合体である。タンパク質の安定性向上のために、GRBC1-7のそれぞれにおいてN末端またはC末端領域に存在するディスオーダー領域を欠損させることを検討した。また、可溶性向上のために、GRBC1-7それぞれのN末端にSUMOタンパク質を付加した状態でpETベクターへクローニングし、IPTGを用いた発現誘導により大腸菌内におけるタンパク質の発現を検討した。SUMOタンパク質と目的タンパク質の間にはタグ切断のためにTEVプロテアーゼ認識配列を付加した。また、ニッケルアフィニティークロマトグラフィーのためのヒスチジンタグの位置を検討した結果、それぞれN末端にタグを付加するのが最適であることが明らかになった。

We have chosen a group for the structural analysis of the supramolecular complex GRB1, which is involved in the molecular mechanism of RNA-dependent RNA assembly and RNA binding. In this study, GRBC complex was refined, RNA and RNA were added, and the GRBC-RNA-RNA complex was reconstructed. The GRBC-RNA-RNA complex was analyzed by electron microscope. This year's research on the construction of a new generation system was carried out. GRBC 7 (GRBC1-7) The stability of GRBC1-7 is improved by the presence of N-terminal and C-terminal domains. In addition, with increasing solubility, the presence of SUMO protein at the N-terminal of GRBC1 -7 was found to be pET betachetarokeroker SUMO quality and quality of time to cut off the TEV quality of time to increase the allocation The result of the position search of the terminal is that the terminal of the N terminal is added to the terminal of the N terminal.

项目成果

CRISPR-C2c2の結晶構造解析

CRISPR-C2c2的晶体结构分析

• 发表时间: 2017
• 作者: 平野央人