Functional and Structural Relationship of V-ATPase Revealed by Single-Molecule Observation

回転型ATPaseは生物に普遍的に存在する分子モータータンパク質であり、ATPの化学結合エネルギーと膜間の電気化学ポテンシャルとを回転運動を介して共役している最小のエネルギー変換装置として知られている。本研究ではその中でもナトリウムイオンを選択的に輸送する腸球菌由来V-ATPaseを用い、その回転機構および反応機構の解明を目指している。2022年度は精製したV-ATPaseの１分子回転計測によりATP加水分解部位とイオン輸送部位との共役機構の一端を明らかにし、その成果を原著論文として発表した。実験の過程でイオン選択性に寄与していると考えられるアミノ酸残基を同定しそれらを変異させることで、腸球菌由来V-ATPaseをナトリウムイオン輸送型からプロトン輸送型に機能転換させることに成功した。この機能転換した変異体の生化学評価および１分子回転挙動を詳細に調べることで、回転型ATPaseにおけるイオン輸送機構の解明が期待できる。並行して、腸球菌由来V-ATPaseの反応可逆性を検証するための生化学測定系およびスクリーニング系の立ち上げ中である。また人工小胞体を用いたナトリウムイオン輸送の定量実験にも取り組んでおり、これら各種生化学測定と１分子回転計測とを組み合わせることで、V-ATPaseの機能と連動した構造ダイナミクス解明を目指す。

回転型ATPaseは生物に普遍的に存在する分子モータータンパク質であり、ATPの化学結合エネルギーと膜間の電気化学ポテンシャルとを回転運動を介して共役している最小のエネルギー変換装置として知られている。本研究ではその中でもナトリウムイオンを選択的に輸送する腸球菌由来V-ATPaseを用い、その回転機構および反応機構の解明を目指している。2022年度は精製したV-ATPaseの１分子回転計測によりATP加水分解部位とイオン輸送部位との共役機構の一端を明らかにし、その成果を原著論文として発表した。実験の過程でイオン選択性に寄与していると考えられるアミノ酸残基を同定しそれらを変異させることで、腸球菌由来V-ATPaseをナトリウムイオン輸送型からプロトン輸送型に機能転換させることに成功した。この機能転換した変異体の生化学評価および１分子回転挙動を詳細に調べることで、回転型ATPaseにおけるイオン輸送機構の解明が期待できる。並行して、腸球菌由来V-ATPaseの反応可逆性を検証するための生化学測定系およびスクリーニング系の立ち上げ中である。また人工小胞体を用いたナトリウムイオン輸送の定量実験にも取り組んでおり、これら各種生化学測定と１分子回転計測とを組み合わせることで、V-ATPaseの機能と連動した構造ダイナミクス解明を目指す。