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Structural analysis of V-ATPase by cryo-EM

通过冷冻电镜对 V-ATP 酶进行结构分析

基本信息

批准号：
22KJ2042
负责人：
中西温子
金额：
$ 2.83万
依托单位：
Osaka University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2023
资助国家：
日本
起止时间：
2023-03-08 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22KJ2042/
关键词：
Cryo-electron microscopy 低温電子顕微鏡 V-ATPase 構造解析 Cryo-electron tomography

项目摘要

V-ATPase (液胞型 ATPase、以下 VoV1 と記す) は、細胞のほとんどの空胞系膜のほか、破骨細胞やがん細胞の細胞膜にも存在し、ATP の加水分解エネルギーを使いプロトンを輸送することで、細胞内外の酸性環境を制御している。VoV1 が形成する酸性環境は、細胞において多くの重要な役割を果たしている一方、VoV1 の機能・構造に関する十分な知見は得られていない。令和3年度の研究では、研究初年度に引き続き、構造解析を行うための哺乳類細胞由来 VoV1 の精製系確立を中心に研究を遂行し、ラット脳組織およびがん細胞から VoV1 を精製することに成功した。精製試料を負染色法にて観察したところ、安定的に精製された VoV1 複合体を確認することができた。次いで、低温電子顕微鏡 (Cryo-EM) による単粒子解析を行うための凍結試料を作製し、Cryo-EM 観察した結果、VoV1 と思われる密度を確認した。一方、細胞内で機能している VoV1 の構造を解析するため、VoV1 が局在する細胞内オルガネラであるシナプス小胞を対象として、トモグラフィー解析を試みた。Cryo-EM を用いて、氷包埋したシナプス小胞の傾斜画像シリーズを取得し、3次元像を再構成した結果、より高分解能の構造解析に適した再構成像を得ることができなかった。解析結果から、傾斜画像間の位置合わせを高精度で行う必要性が示唆されたことから、試料作製方法を最適化する必要があることが明らかとなった。また、より高分解能で構造解析を行うための Cryo-EM 画像の収集方法についても現在検討を行なっている。

V-ATPase (cellular ATPase, hereinafter referred to as VoV1) is responsible for the transport of ATP to and from the cell membrane, the existence of osteoclast and cell membrane, and the control of acidic environments inside and outside the cell. The acidic environment in which VoV1 is formed has many important effects on cell growth, and the function and structure of VoV1 are very important. In the first three years of research, the study was conducted successfully, and the structure analysis was carried out. The origin of mammalian cells was established. The purification system of VoV1 was established successfully. Refined samples were examined by negative staining, and stable VoV1 complex was identified. Cryo-EM observation results, VoV1 and density confirmation of frozen samples were obtained. The analysis of the structure of VoV1 in a cell and the function of VoV1 in a cell are tried. Cryo-EM is used to obtain the results of reconstruction of three-dimensional images, and the results of structural analysis of high-resolution images are obtained. Analysis results, the position of the tilt image, the need for high precision, the need for optimization of the sample preparation method High resolution, structural analysis, and collection methods for Cryo-EM portraits