Structural analysis of V-ATPase by cryo-EM

通过冷冻电镜对 V-ATP 酶进行结构分析

基本信息

批准号：
22KJ2042
负责人：
中西温子
金额：
$ 2.83万
依托单位：
Osaka University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2023
资助国家：
日本
起止时间：
2023-03-08 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22KJ2042/
关键词：
Cryo-electron microscopy 低温電子顕微鏡 V-ATPase 構造解析 Cryo-electron tomography

项目摘要

V-ATPase (液胞型 ATPase、以下 VoV1 と記す) は、細胞のほとんどの空胞系膜のほか、破骨細胞やがん細胞の細胞膜にも存在し、ATP の加水分解エネルギーを使いプロトンを輸送することで、細胞内外の酸性環境を制御している。VoV1 が形成する酸性環境は、細胞において多くの重要な役割を果たしている一方、VoV1 の機能・構造に関する十分な知見は得られていない。令和3年度の研究では、研究初年度に引き続き、構造解析を行うための哺乳類細胞由来 VoV1 の精製系確立を中心に研究を遂行し、ラット脳組織およびがん細胞から VoV1 を精製することに成功した。精製試料を負染色法にて観察したところ、安定的に精製された VoV1 複合体を確認することができた。次いで、低温電子顕微鏡 (Cryo-EM) による単粒子解析を行うための凍結試料を作製し、Cryo-EM 観察した結果、VoV1 と思われる密度を確認した。一方、細胞内で機能している VoV1 の構造を解析するため、VoV1 が局在する細胞内オルガネラであるシナプス小胞を対象として、トモグラフィー解析を試みた。Cryo-EM を用いて、氷包埋したシナプス小胞の傾斜画像シリーズを取得し、3次元像を再構成した結果、より高分解能の構造解析に適した再構成像を得ることができなかった。解析結果から、傾斜画像間の位置合わせを高精度で行う必要性が示唆されたことから、試料作製方法を最適化する必要があることが明らかとなった。また、より高分解能で構造解析を行うための Cryo-EM 画像の収集方法についても現在検討を行なっている。

V-ATPase（液泡ATPase，以下称为VOV1）都存在于细胞的大多数液泡膜以及破骨细胞和癌细胞的细胞膜中，并通过使用ATP的水解能量运输质子来控制细胞内部和外部的酸性环境。尽管VOV1形成的酸性环境在细胞中起许多重要的作用，但尚未获得有关VOV1功能和结构的足够知识。在研究第一年之后的2021年研究中，我们进行了研究，重点是建立哺乳动物细胞衍生的VOV1进行结构分析的纯化系统，并从大鼠脑组织和癌细胞中成功纯化了VOV1。当使用阴性染色方法观察纯化的样品时，有可能确认稳定的纯化VOV1复合物。接下来，制备冷冻样品进行单个颗粒分析，并通过冷冻EM观察结果，确认了被认为是VOV1的密度。另一方面，为了分析细胞内VOV1功能的结构，我们试图在Synaptic囊泡上分析层析成像，这是VOV1所在的细胞内细胞器。使用冷冻EM，我们获得了一系列冰膜突触囊泡的倾斜图像并重建了三维图像，因此，我们无法获得适合于更高分辨率结构分析的重建图像。分析结果表明，需要在倾斜的图像之间执行高精度对准的需求，表明有必要优化样品制备方法。我们目前还在考虑如何以更高的分辨率收集冷冻EM图像进行结构分析。