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空間的な単一細胞の遺伝子発現解析による始原生殖細胞の潜在的多能性の制御機構解明

通过空间单细胞基因表达分析阐明原始生殖细胞潜在多能性的调控机制

基本信息

批准号：
21K15107
负责人：
池田宏輝
金额：
$ 3万
依托单位：
Nara Medical University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
财政年份：
2021
资助国家：
日本
起止时间：
2021-04-01 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

本研究の目的は、移動期の個々の始原生殖細胞とその周辺環境を構成する細胞の詳細な遺伝子発現解析により、生体内における適切な多能性や分化の制御機構、これに関わる微小環境との相互作用の分子基盤を解明することである。組織内における配置情報とリンクした単一細胞レベルでの詳細な遺伝子発現情報の取得手法の開発について、前年度に決定した手法を用いて、マウスの卵巣を包埋、脱水固定、染色し、卵胞中の卵母細胞、及びその卵母細胞に隣接する顆粒膜細胞と隣接しない顆粒膜細胞をLCMにより単一細胞レベルで切り出し、取得し、cDNA合成の後、定量的PCRによる主要遺伝子の定量により、固定切片上の単一細胞からのRNA回収とcDNA合成効率を評価した。その結果、これまで、培養細胞(マウスのES細胞)で得られていたことと同様に、卵母細胞、顆粒膜細胞の両者から網羅的な遺伝子発現を解析するに十分な質のcDNAを合成できていることが確認できた。さらに、当該cDNAよりNGSライブラリーを作製し、トランスクリプトームの詳細な解析したところ、各細胞において5000～15000程度の遺伝子が検出できていることが確認できた。このことは、我々が開発した手法を用いることで脱水固定し、染色した組織から単一細胞レベルでトランスクリプトームを詳細に解析することが可能であることを示唆している。加えて、単一の顆粒膜細胞のトランスクリプトームを卵母細胞からの位置情報と結び付けて解析することで、卵母細胞に隣接するか、卵母細胞より離れているかで同じ顆粒膜細胞であっても遺伝子発現プロファイルが異なっていることを見出した。

The purpose of this study is to elucidate the molecular basis for the interaction between protogerm cells and their surrounding environments during migration, and to elucidate the molecular basis for the detailed analysis of germ cell development, in vivo pluripotency, and differentiation control mechanisms. Disposition information in tissue, single cell cycle, detailed gene expression information, acquisition procedure, prior year determination procedure, egg embedding, desiccation fixation, staining, oocyte in oocyte, and adjacent granular membrane cells in oocyte LCM, single cell cycle, acquisition procedure, cDNA synthesis procedure Quantification of major genes by quantitative PCR, RNA recovery from single cells on fixed sections, and cDNA synthesis efficiency were evaluated. The results of this study were as follows: (1) The synthesis of cDNA in cultured cells (ES cells) was confirmed by the analysis of the gene expression in oocytes, granulosa cells, and host cells. In addition, when the cDNA sequence is controlled, the cDNA sequence is analyzed in detail, and the cDNA sequence is detected at a level of 5000~15000 in each cell. This is the first time that we have been able to open up a new way to use this technology. This is the first time that we have been able to open up a new way to use this technology. This is the second time that we have been able to open up a new way to use this technology. Add information on the location of oocytes and the analysis of oocytes, oocytes, and granular membrane cells.