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空間的な単一細胞の遺伝子発現解析による始原生殖細胞の潜在的多能性の制御機構解明

通过空间单细胞基因表达分析阐明原始生殖细胞潜在多能性的调控机制

基本信息

批准号：
21K15107
负责人：
池田宏輝
金额：
$ 3万
依托单位：
Nara Medical University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
财政年份：
2021
资助国家：
日本
起止时间：
2021-04-01 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

本研究の目的は、移動期の個々の始原生殖細胞とその周辺環境を構成する細胞の詳細な遺伝子発現解析により、生体内における適切な多能性や分化の制御機構、これに関わる微小環境との相互作用の分子基盤を解明することである。組織内における配置情報とリンクした単一細胞レベルでの詳細な遺伝子発現情報の取得手法の開発について、前年度に決定した手法を用いて、マウスの卵巣を包埋、脱水固定、染色し、卵胞中の卵母細胞、及びその卵母細胞に隣接する顆粒膜細胞と隣接しない顆粒膜細胞をLCMにより単一細胞レベルで切り出し、取得し、cDNA合成の後、定量的PCRによる主要遺伝子の定量により、固定切片上の単一細胞からのRNA回収とcDNA合成効率を評価した。その結果、これまで、培養細胞(マウスのES細胞)で得られていたことと同様に、卵母細胞、顆粒膜細胞の両者から網羅的な遺伝子発現を解析するに十分な質のcDNAを合成できていることが確認できた。さらに、当該cDNAよりNGSライブラリーを作製し、トランスクリプトームの詳細な解析したところ、各細胞において5000～15000程度の遺伝子が検出できていることが確認できた。このことは、我々が開発した手法を用いることで脱水固定し、染色した組織から単一細胞レベルでトランスクリプトームを詳細に解析することが可能であることを示唆している。加えて、単一の顆粒膜細胞のトランスクリプトームを卵母細胞からの位置情報と結び付けて解析することで、卵母細胞に隣接するか、卵母細胞より離れているかで同じ顆粒膜細胞であっても遺伝子発現プロファイルが異なっていることを見出した。

The purpose of this study is to analyze the detailed analysis of individual primordial germ cells during the migration period, the surrounding environment and the structure of the cells, and the living body The control mechanism of the internal control of pluripotency and differentiation, the microenvironment of the microenvironment, and the interaction of the molecular base are explained by the control mechanism. Detailed information on the deployment of information within the organization and the details of the organization's information and the method of obtaining the information, the previous year The technique used in deciding the decision is to use the oocyte embedding, dehydration fixation, staining, oocyte in the egg cell, and adjacent oocyte in the oocyte. Granular membrane cells and adjacent granular membrane cells をLCM により Single cells レベルでり出し, acquisition, cDNA synthesis, and quantification The main parameters of PCR are quantitative analysis, RNA recovery from single cells on fixed sections, and evaluation of cDNA synthesis efficiency.そのRESULTS, これまで, cultured cells (マウスのES cells) でgetられていたことと同様に, oocytes, granulosa membrane cells The analysis of the remaining DNA of the cell and the synthesis of cDNA is a confirmation of the results.さらに、When the cDNA is made by NGSライブラリーを, and the トランスクリプトームのdetailed analysis is doneところ、Each cell is made of 5000~15000 degree の伝子が検出できていることがconfirmationできた.このことは、My 々がopen発したtechniqueをUsing いることでdehydration fixationし、stainingしたtissueから単One cellレベルでトランスクリプトームをDetailsにanalyticsすることがpossibleであることをshows唆している. Add えて, 単一の granulosa membrane cell のトランスクリプトームをoocyte からの location information と knot び pay けて analysis することで, oocyte に neighbor The connection of oocyte and oocyte separation is the same as that of granulosa cells.ても缝子発 appear プロファイルがdifferent なっていることを见出した.