細胞内共生藻の光合成産物供給が宿主の性質に与える影響の解析

内共生藻类光合产物供给对寄主特性的影响分析

基本信息

批准号：
21K15148
负责人：
柴田あいか
金额：
$ 2.91万
依托单位：
University of Tsukuba (2022)Ritsumeikan University (2021)
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
财政年份：
2021
资助国家：
日本
起止时间：
2021-04-01 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

前年度に引き続き、エレクトロポレーション法を用いた共生クロレラへの物質導入の検討を行った。細胞への導入効率を評価するために蛍光物質（FITC-デキストラン）をエレクトロポレーション法で細胞内に導入した。その結果、FITC-デキストランはその分子量に関わらず、細胞への導入効率が非常に高く、ほとんどの細胞が蛍光ラベルされた。このため核酸またはタンパク質導入時の効率を評価するのに適切な実験系であるかは疑わしい。しかし、細胞質を効率よく蛍光標識する方法としては有用だと考えており、宿主細胞内での共生クロレラの動態を観察する方法の一つとして利用できると考えている。今後はクロレラの分裂回数に伴って蛍光量が減少していく様子を定量する予定である。その他に、リコンビナントCas9タンパク質/ガイドRNA複合体を導入することによるゲノム編集実験系の構築を目指した。Adenine phosphoribosyltransferase遺伝子をターゲットとし、ノックアウト株を2-Fluoroadenineによって選抜する方法を試した。その結果、擬陽性株が多くあらわれ、薬剤選抜の方法に改良が必要であると考えられた。また、ミドリゾウリムシ宿主の光運動反応を共生クロレラが制御するメカニズムについて明らかにするため、ミドリゾウリムシの光運動反応を繊毛の運動変化に注目して観察を行った。ミドリゾウリムシが感知できない遠赤色光を観察光として用いたハイスピードカメラでの観察や、トラップした１細胞での光刺激の有無による繊毛の運動変化の観察を試みたが、十分なデータを得るに至っていない。ゾウリムシは細胞全体に繊毛を持つため、すべての繊毛の運動を同時に解析することは難しい。そのため、光の有無によって細胞運動が変化するときに繊毛運動が細胞のどの部分で起こっているのかをまず先に明らかにすることが必要であることが分かった。

从上一年开始，我们使用电穿孔方法研究了物质引入共生小球藻。为了评估转导向细胞的效率，通过电穿孔引入荧光物质（FITC-脱离）。结果，FITC-DEXTRAN无论其分子量如何，都非常有效地转移到细胞中，并且大多数细胞都被荧光标记。因此，令人怀疑的是，这是否是一个适当的实验系统，用于评估引入核酸或蛋白质时的效率。但是，我们认为它可作为有效荧光标记细胞质的方法，并且可以用作观察宿主细胞中共生小球藻动力学的方法之一。将来，我们计划通过小球藻分裂的数量来量化荧光的减少。此外，我们旨在通过引入重组CAS9蛋白/引导RNA复合物来构建基因组编辑实验系统。试图靶向腺嘌呤磷酸蛋白酶基转移酶基因，并通过2-氟腺嘌呤选择敲除菌株。结果，出现了许多假阳性菌株，人们认为需要改善药物选择方法。此外，为了阐明共生小球藻调节pragecium宿主的光态反应的机制，我们观察到了甲虫甲虫的光态反应，并注意纤毛变化。我们试图使用远红色的光观察高速摄像头，表明甲状腺素无法检测为观察光，并观察由于一个被困的一个细胞中存在或不存在光刺激而导致纤毛运动的变化，但尚未获得足够的数据。 Pragecium在整个细胞中都有纤毛，因此很难同时分析所有纤毛的运动。因此，已经发现，当细胞运动变化时，根据存在或不存在光线时，必须首先阐明细胞运动的哪一部分正在发生。