Elucidation of the mechanism of disease severity caused by SARS-CoV-2 focusing on the incompatibility between by virus and host

阐明 SARS-CoV-2 引起疾病严重程度的机制，重点关注病毒与宿主之间的不相容性

• 批准号: 21K15455
• 负责人: 荒井 泰葉
• 金额: $ 2.91万
• 依托单位: Kyoto Prefectural University of Medicine
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
• 财政年份: 2021
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2021-04-01 至 2023-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-21K15455/
• 关键词: SARS-CoV-2; RIG-I; 新型コロナウイルス; 宿主適応; 重症化

初年度では、短鎖viral RNAの代表的な配列に基づき複数種の短鎖viral RNAをin vitro transcription により合成し、当該RNAの配列と長さの違いによるサイトカイン誘導性を解析した。また、合成した短鎖viralRNAの特徴（二次構造、脱リン酸化、キャップ構造の有無）によるサイトカイン誘導性を確認することで、非自己RNAセンサーによる短鎖viral RNAの認識機構を明らかにした。さらに、非自己RNAセンサーをsiRNA導入によりノックダウンし、短鎖viral RNAによる免疫誘導の消失を確認している。本年度では、短鎖viral RNA代表配列を対象としたstem-loop RT-PCRを構築し感染経過時間ごとに細胞中における短鎖viral RNA量を定量し、細胞内での非自己RNAセンサーの発現量との関連性を評価した。また、本研究で対象とする短鎖viral RNA はその長さから、宿主のmicro RNAのようにエクソソーム中に効率よく含有されると予想されるため、感染細胞培養上製中に含まれるエクソソームを単離し、small RNA-seqにより解析を行った。これらの解析により、細胞中の短鎖viral RNA量が感染後期において細胞内に多く蓄積され、相関して非自己RNAセンサーの発現も上昇することを確認した。またエクソソーム中においては、感染細胞中と同様の短鎖viral RNAを検出することができた。本研究では新型コロナウイルスが産生する短鎖viral RNAに着目し、当該RNAが感染時病態の重症化に与える影響について評価した。短鎖viral RNAはその特徴から、細胞内のサイトカイン産生を強く誘導しており、生体内で短鎖viral RNAが多量に産生される場合にはサイトカインストームを引き起こす一因子なり得ると推察される。

In the early years, the expression of short-locked viral RNA was analyzed by gene sequencing and in vitro transcription. The characteristics of synthetic short-locked viral RNA (secondary structure, deacidification, presence or absence of structure), identification of induction of short-locked viral RNA, identification of recognition mechanisms of short-locked viral RNA, and identification of non-self-contained RNA. In addition, non-self-RNA siRNA introduction, short-chain viral RNA, and immune induction were confirmed. This year, we constructed stem-loop RT-PCR to quantify the amount of short-locked viral RNA in cells and evaluate the correlation between the amount of non-self-RNA in cells and the expression of RNA. In this study, we analyzed the expression of short-locked viral RNA in vitro, microRNA in host cells, microRNA in infected cells and microRNA in culture. The amount of short-chain viral RNA in the cells was confirmed to be increased during the late stages of infection due to intracellular accumulation and related non-self-RNA expression. The virus was detected in infected cells and the same short-chain viral RNA was detected in infected cells. In this study, we evaluated the effects of short-locked viral RNA on the development of novel viral infections, and on the pathogenesis of viral RNA infections. Due to its unique characteristics, short-locked viral RNA can strongly induce the production of viral RNA in cells, and when short-locked viral RNA is produced in large quantities in vivo, it can be used as a factor to induce the production of viral RNA.