免疫チェックポイント分子リガンドを制御するmiRNAを用いたバイオマーカー開発

免疫チェックポイント分子のリガンドであるPVRを制御するmicroRNA（miRNA）を同定するため、TargetScanなどのonline prediction toolsを用いて、PVR（CD155）の3’UTRに相補的に結合し得るmiRNAの上位10種類を選定した。続いてin vitroでのスクリーニング検査として、デュアルルシフェラーゼ法を用いることとした。PVRの3’UTRを挿入したデュアルルシフェラーゼプラスミドおよび各候補miRNA mimicをHEK293細胞株に共導入し、ルシフェラーゼの発光強度を測定したところ、4種類のmiRNAにおいてコントロールに対するルシフェラーゼの発光強度の減弱を認めた。さらに、それぞれのmiRNAが結合すると考えられるPVR 3’UTRの相補配列部位に変異配列を導入することで、発光強度の減弱はキャンセルされることが示された。このように選定した4種類の候補miRNAのmimicをA549細胞株に導入し、遺伝子・タンパク質の発現をreal-time PCR法、FACS、WB法にて測定したところ、2種類のmiRNAにおいてPVRのmRNA・タンパク質発現の低下がみられた。In vitro解析により同定されたmiRNAが肺臨床検体においてもPVRの発現制御に関与することを示すため、肺癌患者の手術検体（腫瘍組織）を用いて、PVRの発現をIHC法にて測定するとともに、腫瘍組織より抽出したRNAを用いてmiRNAを測定し、両者の相関を解析したところ、腫瘍組織におけるPVRの発現とIn vitro解析により同定されたmiRNAのうち1種類において、負の相関が示された。以上、in vitroおよび臨床検体を用いた解析により、免疫チェックポイント分子のリガンドであるPVRを制御するmiRNAを同定するに至った。

免疫チェックポイント分子のリガンドであるPVRを制御するmicroRNA（miRNA）を同定するため、TargetScanなどのonline prediction toolsを用いて、PVR（CD155）の3’UTRに相補的に結合し得るmiRNAの上位10種類を選定した。続いてin vitroでのスクリーニング検査として、デュアルルシフェラーゼ法を用いることとした。PVRの3’UTRを挿入したデュアルルシフェラーゼプラスミドおよび各候補miRNA mimicをHEK293細胞株に共導入し、ルシフェラーゼの発光強度を測定したところ、4種類のmiRNAにおいてコントロールに対するルシフェラーゼの発光強度の減弱を認めた。さらに、それぞれのmiRNAが結合すると考えられるPVR 3’UTRの相補配列部位に変異配列を導入することで、発光強度の減弱はキャンセルされることが示された。このように選定した4種類の候補miRNAのmimicをA549細胞株に導入し、遺伝子・タンパク質の発現をreal-time PCR法、FACS、WB法にて測定したところ、2種類のmiRNAにおいてPVRのmRNA・タンパク質発現の低下がみられた。In vitro解析により同定されたmiRNAが肺臨床検体においてもPVRの発現制御に関与することを示すため、肺癌患者の手術検体（腫瘍組織）を用いて、PVRの発現をIHC法にて測定するとともに、腫瘍組織より抽出したRNAを用いてmiRNAを測定し、両者の相関を解析したところ、腫瘍組織におけるPVRの発現とIn vitro解析により同定されたmiRNAのうち1種類において、負の相関が示された。以上、in vitroおよび臨床検体を用いた解析により、免疫チェックポイント分子のリガンドであるPVRを制御するmiRNAを同定するに至った。