細胞外小胞に内包される神経・グリア特異蛋白を用いた認知症血液バイオマーカーの開発

使用细胞外囊泡中包含的神经/神经胶质特异性蛋白质开发痴呆症的血液生物标志物

• 批准号: 21K15682
• 负责人: 赤嶺 祥真
• 金额: $ 3万
• 依托单位: Osaka University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
• 财政年份: 2021
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2021-04-01 至 2024-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-21K15682/
• 关键词: 細胞外小胞; プロテアーゼ保護アッセイ; エクソソーム; バイオマーカー; アルツハイマー病; リキッドバイオプシー

本年度は、初年度に引き続いてプロテアーゼ処理条件の最適化を実施した。最適化に際しては、一定量の血漿EV分画に含まれる大部分がEV外に存在すると考えられるタンパクが十分に消化されること、および下流測定系への影響が最低限となるようにプロテアーゼが不活化されることを主な指標とした。非EV関連タンパクおよびEV関連タンパクのうち膜外に一部ないし全体が露出していると考えられるものについて、複数種類においてwestern blottingによる検討を行った。初年度で同定された「EV外に一部が露出しているにも関わらず、プロテアーゼによる分解を受けない、翻訳後修飾によるプロテアーゼ耐性を持つタンパク」を除いて、EV外タンパクが十分に消化される条件を、複数の組み合わせ（酵素濃度・反応温度・時間など）で同定した。続いて、この条件群に対して、プロテアーゼ活性を十分に阻害するのに必要な阻害条件を検討した。酵素阻害が十分に行われた事の確認には、自己消光を応用したFTC-Casein系によるプロテアーゼ活性アッセイを用いた。この結果、複数の反応条件候補（酵素濃度・反応温度・時間・阻害手法の組み合わせ）を得た。これらのうち、高温での処理を必要とするものは高感度測定系に移行する際にアナライトの変性等を惹起する可能性があるために一時的に検討対象外とし、より穏やかな温度条件で実施可能な他の条件群について、高感度測定系での適合性を評価した。その結果、最もバックグラウンドシグナルが低い反応条件を絞りこむことが出来た。この条件において、少ないサンプル数では神経・グリア細胞に特異的なタンパクが測定可能であることを確認した。次年度（最終年度）は、この反応条件に基づいて患者血漿における測定を実施し、その妥当性および再現性を検証する。

The optimization of treatment conditions was carried out in the first half of this year. In the optimization process, a certain amount of plasma EV fraction is included, and most of the EV fraction is present. Non-EV-related substances are not included in the list of substances, but are included in the list of substances. At the beginning of the year, the same results were obtained: "A part of EV outer layer is exposed to light, the decomposition of EV outer layer is affected by light, the modification of EV outer layer is affected by light, the tolerance of EV outer layer is maintained by light", and the conditions and combinations of EV outer layer are determined (enzyme concentration, reaction temperature and time). In addition, the group of conditions is discussed, and the necessary inhibiting conditions are discussed. Enzyme inhibition is very important for the identification of enzyme activity, and the use of FTC-Casein is very important for enzyme activity. The result, multiple reaction conditions candidate (enzyme concentration, reaction temperature, time, inhibition method combination) are obtained. For example, if the temperature is high, the processing is necessary, and if the high sensitivity measurement system is suitable, the possibility of causing a change in the temperature is discussed. The result of the test is that the most important factor is the condition of low and middle temperature. This condition is called "the number of cells" and "the number of cells" is called "the number of cells". The following year (final year) is a review of the adequacy and reproducibility of the measurement of plasma samples based on these baseline conditions.