細胞外小胞に内包される神経・グリア特異蛋白を用いた認知症血液バイオマーカーの開発

本年度は、初年度に引き続いてプロテアーゼ処理条件の最適化を実施した。最適化に際しては、一定量の血漿EV分画に含まれる大部分がEV外に存在すると考えられるタンパクが十分に消化されること、および下流測定系への影響が最低限となるようにプロテアーゼが不活化されることを主な指標とした。非EV関連タンパクおよびEV関連タンパクのうち膜外に一部ないし全体が露出していると考えられるものについて、複数種類においてwestern blottingによる検討を行った。初年度で同定された「EV外に一部が露出しているにも関わらず、プロテアーゼによる分解を受けない、翻訳後修飾によるプロテアーゼ耐性を持つタンパク」を除いて、EV外タンパクが十分に消化される条件を、複数の組み合わせ（酵素濃度・反応温度・時間など）で同定した。続いて、この条件群に対して、プロテアーゼ活性を十分に阻害するのに必要な阻害条件を検討した。酵素阻害が十分に行われた事の確認には、自己消光を応用したFTC-Casein系によるプロテアーゼ活性アッセイを用いた。この結果、複数の反応条件候補（酵素濃度・反応温度・時間・阻害手法の組み合わせ）を得た。これらのうち、高温での処理を必要とするものは高感度測定系に移行する際にアナライトの変性等を惹起する可能性があるために一時的に検討対象外とし、より穏やかな温度条件で実施可能な他の条件群について、高感度測定系での適合性を評価した。その結果、最もバックグラウンドシグナルが低い反応条件を絞りこむことが出来た。この条件において、少ないサンプル数では神経・グリア細胞に特異的なタンパクが測定可能であることを確認した。次年度（最終年度）は、この反応条件に基づいて患者血漿における測定を実施し、その妥当性および再現性を検証する。

本年度は、初年度に引き続いてプロテアーゼ処理条件の最適化を実施した。最適化に際しては、一定量の血漿EV分画に含まれる大部分がEV外に存在すると考えられるタンパクが十分に消化されること、および下流測定系への影響が最低限となるようにプロテアーゼが不活化されることを主な指標とした。非EV関連タンパクおよびEV関連タンパクのうち膜外に一部ないし全体が露出していると考えられるものについて、複数種類においてwestern blottingによる検討を行った。初年度で同定された「EV外に一部が露出しているにも関わらず、プロテアーゼによる分解を受けない、翻訳後修飾によるプロテアーゼ耐性を持つタンパク」を除いて、EV外タンパクが十分に消化される条件を、複数の組み合わせ（酵素濃度・反応温度・時間など）で同定した。続いて、この条件群に対して、プロテアーゼ活性を十分に阻害するのに必要な阻害条件を検討した。酵素阻害が十分に行われた事の確認には、自己消光を応用したFTC-Casein系によるプロテアーゼ活性アッセイを用いた。この結果、複数の反応条件候補（酵素濃度・反応温度・時間・阻害手法の組み合わせ）を得た。これらのうち、高温での処理を必要とするものは高感度測定系に移行する際にアナライトの変性等を惹起する可能性があるために一時的に検討対象外とし、より穏やかな温度条件で実施可能な他の条件群について、高感度測定系での適合性を評価した。その結果、最もバックグラウンドシグナルが低い反応条件を絞りこむことが出来た。この条件において、少ないサンプル数では神経・グリア細胞に特異的なタンパクが測定可能であることを確認した。次年度（最終年度）は、この反応条件に基づいて患者血漿における測定を実施し、その妥当性および再現性を検証する。