細胞外小胞に内包される神経・グリア特異蛋白を用いた認知症血液バイオマーカーの開発

使用细胞外囊泡中包含的神经/神经胶质特异性蛋白质开发痴呆症的血液生物标志物

• 批准号: 21K15682
• 负责人: 赤嶺 祥真
• 金额: $ 3万
• 依托单位: Osaka University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
• 财政年份: 2021
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2021-04-01 至 2024-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-21K15682/
• 关键词: 細胞外小胞; プロテアーゼ保護アッセイ; エクソソーム; バイオマーカー; アルツハイマー病; リキッドバイオプシー

本年度は、初年度に引き続いてプロテアーゼ処理条件の最適化を実施した。最適化に際しては、一定量の血漿EV分画に含まれる大部分がEV外に存在すると考えられるタンパクが十分に消化されること、および下流測定系への影響が最低限となるようにプロテアーゼが不活化されることを主な指標とした。非EV関連タンパクおよびEV関連タンパクのうち膜外に一部ないし全体が露出していると考えられるものについて、複数種類においてwestern blottingによる検討を行った。初年度で同定された「EV外に一部が露出しているにも関わらず、プロテアーゼによる分解を受けない、翻訳後修飾によるプロテアーゼ耐性を持つタンパク」を除いて、EV外タンパクが十分に消化される条件を、複数の組み合わせ（酵素濃度・反応温度・時間など）で同定した。続いて、この条件群に対して、プロテアーゼ活性を十分に阻害するのに必要な阻害条件を検討した。酵素阻害が十分に行われた事の確認には、自己消光を応用したFTC-Casein系によるプロテアーゼ活性アッセイを用いた。この結果、複数の反応条件候補（酵素濃度・反応温度・時間・阻害手法の組み合わせ）を得た。これらのうち、高温での処理を必要とするものは高感度測定系に移行する際にアナライトの変性等を惹起する可能性があるために一時的に検討対象外とし、より穏やかな温度条件で実施可能な他の条件群について、高感度測定系での適合性を評価した。その結果、最もバックグラウンドシグナルが低い反応条件を絞りこむことが出来た。この条件において、少ないサンプル数では神経・グリア細胞に特異的なタンパクが測定可能であることを確認した。次年度（最終年度）は、この反応条件に基づいて患者血漿における測定を実施し、その妥当性および再現性を検証する。

今年，在第一年之后，我们优化了蛋白酶治疗条件。在优化过程中，主要指标是，被认为在一定量的血浆EV级分中被认为在EV之外的等离子体EV馏分中大量消化的蛋白质，并且蛋白酶被灭活以最大程度地减少其对下游测量系统的影响。使用Western印迹检查了多种非EV相关蛋白和与EV相关的蛋白，这些蛋白被认为部分或完全暴露在膜外。通过多种组合（酶浓度，反应温度，时间等）鉴定出足够消化EV蛋白的条件，除了“由于翻译后修饰引起的蛋白酶抗蛋白酶的蛋白质，即使在第一年的EV中均未透露蛋白酶的蛋白酶，即使在蛋白酶降低的情况下也不会受到蛋白酶的降解。随后，检查了这组疾病的充分抑制蛋白酶活性所需的抑制条件。为了确认酶抑制作用足够，使用了使用自我淬灭的FTC-Casein系统进行蛋白酶活性测定。结果，获得了多个候选反应条件（酶浓度，反应温度，时间和抑制技术的组合）。其中，那些在高温下暂时排除了在高温下进行治疗的人，因为它们可能在过渡到高敏感的测量系统时会导致分析物的变性，以及在温度温度条件下可以在温度温度条件下实施的其他条件，以评估与高敏感测量系统的兼容性。结果，背景信号最低的反应条件被缩小。在这些条件下，可以证实，可以用少数样品测量针对神经细胞的蛋白质。在第二年（最后一年），将根据这些反应条件进行患者血浆的测量，以验证其有效性和可重复性。