ヒアルロン酸合成酵素の遺伝子導入による新たな変形性膝関節症の治療に向けて

申請時に記載したIn vitroの先行研究に続くin vivo実験として、研究計画にあったDMM OAモデルマウスの作成を行い、OA変化が生じていることの確認を行うため、DMM OAモデルマウスを作成後、マウス膝関節を採取し、組織標本を悪性後、HE染色、サフラニンO（S-O）染色などをおこなった。OAモデルマウスにおいてはS-O染色において濃染するプロテオグリカンに富んだ組織が大きく減少しており、プロテオグリカンの喪失が生じていることを確認した。DMM OAモデルマウスの作成に関しては確認ができたと考えている。また同組織における免疫組織化学染色を行いMMP-3、-13の発現解析により各種分解酵素のタンパクの発現上昇、局在を確認した。上記の作成したDMM OAモデルマウスを用いて、現在本研究と平行してその効果に関する研究を行っているヒアルロン酸合成阻害剤である4-Methylumbelliferone, 4-MUをマウス膝関節内に投与し、上述した各種OA変化が抑制されることを確認した。それらの成果は「Journal of orthopaedic research, 2020」で報告されている。同様にDMM OAモデルマウスを作成し、膝関節内にドキシサイクリン誘導型のHAS2過剰発現アデノウイルスベクターを膝関節に投与、ベクターによる遺伝子導入がされるか、又、ドキシサイクリンの内服によって過剰発現が生じるかについてin vivoの実験を行っていたが、マウスの餌にドキシサイクリンを含有させる手法による関節内組織でのHAS2過剰発現を様々な方法で確認したが、最終的に確認するに至らなかった。ドキシサイクリン誘導型のHAS2過剰発現アデノウイルスベクターの使用は断念し、現在Adeno-HAS2-ZsGreenというドキシサイクリンを用いない恒常発現型のベクターを用いた実験を進めている。

申請時に記載したIn vitroの先行研究に続くin vivo実験として、研究計画にあったDMM OAモデルマウスの作成を行い、OA変化が生じていることの確認を行うため、DMM OAモデルマウスを作成後、マウス膝関節を採取し、組織標本を悪性後、HE染色、サフラニンO（S-O）染色などをおこなった。OAモデルマウスにおいてはS-O染色において濃染するプロテオグリカンに富んだ組織が大きく減少しており、プロテオグリカンの喪失が生じていることを確認した。DMM OAモデルマウスの作成に関しては確認ができたと考えている。また同組織における免疫組織化学染色を行いMMP-3、-13の発現解析により各種分解酵素のタンパクの発現上昇、局在を確認した。上記の作成したDMM OAモデルマウスを用いて、現在本研究と平行してその効果に関する研究を行っているヒアルロン酸合成阻害剤である4-Methylumbelliferone, 4-MUをマウス膝関節内に投与し、上述した各種OA変化が抑制されることを確認した。それらの成果は「Journal of orthopaedic research, 2020」で報告されている。同様にDMM OAモデルマウスを作成し、膝関節内にドキシサイクリン誘導型のHAS2過剰発現アデノウイルスベクターを膝関節に投与、ベクターによる遺伝子導入がされるか、又、ドキシサイクリンの内服によって過剰発現が生じるかについてin vivoの実験を行っていたが、マウスの餌にドキシサイクリンを含有させる手法による関節内組織でのHAS2過剰発現を様々な方法で確認したが、最終的に確認するに至らなかった。ドキシサイクリン誘導型のHAS2過剰発現アデノウイルスベクターの使用は断念し、現在Adeno-HAS2-ZsGreenというドキシサイクリンを用いない恒常発現型のベクターを用いた実験を進めている。