Novel regulatory mechanism of cartilage calcification via linkage between AGEs and CCN2 in endochondral ossification

本年度の計画は、内軟骨性骨化過程におけるAGEsレベルの変動、軟骨においてAGEsがCCN2の発現・産生に及ぼす影響、軟骨においてCCN2がAGEsレベルに及ぼす影響、AGEsとCCN2が内軟骨性骨化過程の“軟骨基質の石灰化”に及ぼす影響を調べることであった。HCS-2/8にAGEs-BSAを添加しても、CCN2の発現は亢進しなかったが、AGEs-BSAとRAGE拮抗剤(FPS-ZM1)を添加すると、むしろ低下した。FPS-ZM1がAGEsの細胞内への取り込みを促進すること、細胞内へ取り込まれたAGEsは細胞内の活性酸素種(ROS)レベルを上昇させることが報告されている。昨年度報告した過酸化水素添加実験の結果を考慮して、今後は、AGEs-BSAの濃度を下げて、CCN2の発現が亢進する条件を追究する予定である。HCS-2/8においてCCN2をノックダウンしても、RAGEの発現は変動しなかった。AGEsは、RAGE系を活性化するだけでなく、前述のように細胞内に取り込まれて作用し、アポトーシスを誘導することもある。以前に研究代表者は、同培養系でROS介在性アポトーシスが誘導されることを見出している。以上より、CCN2の発現が低下すると、AGEsの細胞内への取り込みが促進される可能性が推察される。今後は、同培養系で細胞内/外AGEsレベルが増/減するか、またその結果がCCN2の組換えタンパク質(rCCN2)の添加により打ち消されるかを検証する予定である。HCS-2/8では石灰化マーカーALPが低発現のためばらつきが大きく、定量比較が困難であった。今後は、野生型マウスの成長板軟骨組織から単離した軟骨細胞の初代培養系において、AGEsレベルを評価するとともに、AGEs-BSA/AGEs生成阻害剤を添加し続けて、カルシウム沈着、ALPの発現・活性が増/減するかを検証する予定である。

本年度の計画は、内軟骨性骨化過程におけるAGEsレベルの変動、軟骨においてAGEsがCCN2の発現・産生に及ぼす影響、軟骨においてCCN2がAGEsレベルに及ぼす影響、AGEsとCCN2が内軟骨性骨化過程の“軟骨基質の石灰化”に及ぼす影響を調べることであった。HCS-2/8にAGEs-BSAを添加しても、CCN2の発現は亢進しなかったが、AGEs-BSAとRAGE拮抗剤(FPS-ZM1)を添加すると、むしろ低下した。FPS-ZM1がAGEsの細胞内への取り込みを促進すること、細胞内へ取り込まれたAGEsは細胞内の活性酸素種(ROS)レベルを上昇させることが報告されている。昨年度報告した過酸化水素添加実験の結果を考慮して、今後は、AGEs-BSAの濃度を下げて、CCN2の発現が亢進する条件を追究する予定である。HCS-2/8においてCCN2をノックダウンしても、RAGEの発現は変動しなかった。AGEsは、RAGE系を活性化するだけでなく、前述のように細胞内に取り込まれて作用し、アポトーシスを誘導することもある。以前に研究代表者は、同培養系でROS介在性アポトーシスが誘導されることを見出している。以上より、CCN2の発現が低下すると、AGEsの細胞内への取り込みが促進される可能性が推察される。今後は、同培養系で細胞内/外AGEsレベルが増/減するか、またその結果がCCN2の組換えタンパク質(rCCN2)の添加により打ち消されるかを検証する予定である。HCS-2/8では石灰化マーカーALPが低発現のためばらつきが大きく、定量比較が困難であった。今後は、野生型マウスの成長板軟骨組織から単離した軟骨細胞の初代培養系において、AGEsレベルを評価するとともに、AGEs-BSA/AGEs生成阻害剤を添加し続けて、カルシウム沈着、ALPの発現・活性が増/減するかを検証する予定である。