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３次元組織培養モデルによるコラーゲンライブイメージングを用いた肝線維化機構の解析

使用 3D 组织培养模型利用胶原实时成像分析肝纤维化机制

基本信息

批准号：
21K18051
负责人：
守矢恒司
金额：
$ 3万
依托单位：
Tokyo Institute of Technology
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
财政年份：
2021
资助国家：
日本
起止时间：
2021-04-01 至 2025-03-31
项目状态：
未结题

项目摘要

本研究では、所属グループで開発された「可視化I型プロコラーゲン発現システム」を利用した3次元肝臓組織培養モデルを構築し、コラーゲン分子の視点から肝線維化発症機構を解明することを目的としている。肝臓内での持続的な炎症反応により静止期の肝星細胞が活性化することで、コラーゲンが過剰産生され、肝線維化が発症する。これまでに、生理的発現量およびサイトカインなどの外部因子に対する応答性を有する「第2世代可視化I型プロコラーゲン発現システム」の開発を実施した。この「第２世代可視化I型プロコラーゲン発現システム」を導入した線維芽細胞では、コラーゲンの転写活性を促進するサイトカインTGF-β1で刺激することで、細胞内蛍光輝度の上昇し、および細胞内タンパク質発現量の増加が認められた。構築した「第２世代可視化I型プロコラーゲン発現システム」が外部因子に対する応答性を有することを確認した。2022年度は、「第２世代可視化I型プロコラーゲン発現」ベクターを、異なる活性化状態を示す2種類のラット肝星細胞株に遺伝子導入し、FACSによるシングルセル単離および薬剤選択により、安定発現株の樹立をおこなった。これにより各細胞株に対し、可視化I型プロコラーゲンを恒常的発現する細胞株を複数取得することに成功した。取得した細胞株は、活性化因子であるTGF-β1により、活性化マーカーであるαSMA遺伝子発現量の増加や静止期マーカーであるPpar-γ遺伝子発現量の低下がみられたことから、親株と同等の性質を保持していた。またTGF-β1による活性化誘導で、可視化I型コラーゲン由来の細胞内蛍光輝度の増加が認められ、かつ、細胞外への分泌量変化も検出されたことから、可視化I型プロコラーゲン発現肝星細胞の樹立に成功したと考える。現在、樹立細胞株を血管内皮細胞との共培養による、3次元組織培養モデル構築を進めている。

This study aims to develop a "visualization model I" for the development of a three-dimensional liver tissue culture system, and to clarify the molecular perspective of liver tissue development mechanisms. Persistent inflammation in the liver, activation of quiescent hepatic stellate cells, production of liver tissue, and development of liver line maintenance The development of the "2nd generation visualization type I development system" was carried out in response to external factors such as physiological and physiological development. The introduction of the "2nd generation visualization of type I protein expression" into the cells promoted the activity of protein expression, stimulated the growth of TGF-β1, increased the intracellular fluorescence intensity, and increased the intracellular protein expression. Build the second generation of visualization I type of discovery system for external factors In 2022, the "2nd Generation Visual Type I Virus Development" will show the activation status of two types of hepatic stellate cell lines, including gene introduction, FACS selection, and establishment of stable development strains. The number of cell lines obtained is constant. Acquiring cell lines that activate TGF-β1, activate αSMA gene production increases, quiescent Par-γ gene production decreases, and parent plants maintain the same properties. The activation of TGF-β1 was induced, and the increase of intracellular luminosity of TGF-β 1 was observed. The secretion of TGF-β 1 was detected, and the successful establishment of hepatocyte was observed. Now, establish cell lines, vascular endothelial cells, and co-culture, three-dimensional tissue culture, and construct.