小胞体標的マンノシダーゼ阻害剤の開発と細胞内糖鎖産生経路解析への応用

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我々は独自の蛍光標識型高マンノース型糖鎖プローブをマウス肝臓から抽出した小胞体画分に添加して、小胞体マンノシダーゼ群の活性を追跡する系を確立してきた。また、in vitroにおいて上記活性を担う3種のマンノシダーゼに対してマンノシダーゼ阻害剤のスクリーニングを通して、2系統の小胞体マンノシダーゼに対する選択的阻害剤を見出した。これをマンノース切断経路解析に供して、別種の小胞体マンノシダーゼが担う独立した2つのマンノース切断経路の存在を示した。本研究の目的は、これまでに見出したin vitroにおける独立した2つのマンノース切断経路の細胞内における存在の検証である。これを達成するために、1) 見出しているマンノシダーゼ阻害剤を細胞内解析ツールにすべく、小胞体標的能を付与した誘導体の合成を行う、2) 細胞内における小胞体糖鎖の静的、動的な糖鎖産生の解析手法を確立する、3) 1) および2) を組み合わせて細胞を用いて小胞体内糖鎖解析を行う。本年度は要素技術となる1) および2) の項目に重点を置き研究を遂行した。1) では、小胞体標的マンノシダーゼ阻害剤の開発に向けて、母格となる阻害剤の大量供給を目指した。初期的な実験ではあるが大量供給可能な簡便な合成ルートの確立に成功している。また、小胞体標的マンノシダーゼ阻害剤の前駆体合成の経路を確立している段階にある。2) では、細胞内における小胞体糖鎖解析に必須な細胞からの小胞体抽出について検討した。既に細胞からの小胞体抽出法は確立していたが、取得できる小胞体量が少量でありかつ細胞種によって取得量にばらつきがあった。この問題に対して抽出法の改変および小胞体抽出に用いる細胞種の選定により、本研究の遂行により適した小胞体画分の抽出法を確立した。