アーキア特有のセレンタンパク質合成機構

古细菌独特的硒蛋白合成机制

基本信息

批准号：
22K14815
负责人：
青野陸
金额：
$ 3万
依托单位：
Ritsumeikan University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
财政年份：
2022
资助国家：
日本
起止时间：
2022-04-01 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-22K14815/
关键词：
セレンタンパク質アーキア翻訳伸長因子 SECIS

项目摘要

アーキアは細菌と同様に原核生物であるが、21番目のアミノ酸であるセレノシステイン (Sec) を含有するセレンタンパク質の合成機構は真核生物に近いと考えられている。Secは本来終止コドンであるUGAに挿入されることが知られており、その挿入にはmRNA上に存在し、ステムループ二次構造を形成するSec挿入配列 (SECIS) を必要とする。真核生物にはSECIS結合タンパク質eSBP2が存在し、Sec-tRNAを運搬するSelBはSECISに結合したeSBP2を認識することでポリペプチド中にSecを挿入する。しかし、真核生物のセレンタンパク質合成において鍵となるeSBP2はアーキアには存在せず、アーキアにおける詳細な合成機構は不明である。本研究ではアーキアにおけるセレンタンパク質合成機構の解明を目指して研究を行っている。本研究の対象として、メタン生成アーキアMethanothermococcus okinawensisを選定した。eSBP2と同様に、アーキアにもSECISに結合してSelBを呼び込むaSBPが存在する可能性を考え、SelBと相互作用するタンパク質の探索を行った。まず大腸菌を用いてHis-tag付加組換え型SelBを調製した。調製した組換え型タンパク質と、M. okinawensisの細胞抽出液を用いてNiカラムによるプルダウンアッセイを行ったところ、SelBと同様の溶出パターンを示すaSBP候補タンパク質がいくつか観察された。また調製した組換え型タンパク質をもとに抗体を作製して免疫沈降を検討したところ、細胞抽出液中のSelBを補足することに成功した。

ARCHEA是一种原核生物，就像细菌一样，但是含有21氨基酸的硒蛋白的合成机制，硒代半胱氨酸（SEC）被认为接近真核生物。已知SEC被插入UGA，该sec最初是终止密码子，其插入需要驻留在mRNA上并形成茎环二级结构的SEC插入序列（SECI）。真核生物包含secis结合蛋白ESBP2，携带SEC-tRNA的SELB识别与Secis结合的ESBP2，从而将SEC插入多肽。但是，ESBP2是真核硒蛋白合成中的关键，在考古学中不存在，而考古学中的详细合成机制尚不清楚。这项研究旨在阐明考古中硒蛋白合成的机制。选择了甲烷癌的甲烷甲状球菌冲绳菌作为本研究的主题。与ESBP2相似，我们考虑了ASBP在Archia中也存在与SECI结合并吸引SELB的可能性，并搜索与SELB相互作用的蛋白质。首先，使用大肠杆菌制备了HIS标签的重组SELB。当使用制备的重组蛋白和使用Ni柱的骨杆菌的细胞提取物进行下拉测定时，观察到几种与SELB相似的洗脱模式的候选ASBP蛋白。此外，根据制备的重组蛋白并研究了免疫沉淀，制备了抗体，并成功地补充了细胞提取物中的SELB。