古細菌が持つ独特なヌクレオチド除去修復機構の解明

阐明古细菌独特的核苷酸切除修复机制

• 批准号: 22K14832
• 负责人: 白石 都
• 金额: $ 2.91万
• 依托单位: Kyushu University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
• 财政年份: 2022
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2022-04-01 至 2026-03-31
• 项目状态: 未结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-22K14832/
• 关键词: 古細菌; アーキア; ヌクレオチド除去修復; DNA修復

本研究は超好熱性古細菌が持つ紫外線損傷修復機構を明らかにすることを目的として進めている。紫外線損傷DNAに特異的に結合するタンパク質の網羅的同定を行った。ビオチン化した(6-4)光産物を含む損傷型と非損傷型の二本鎖DNAを用意し、超好熱性古細菌Thermococcus kodakarensis細胞抽出液からこれに結合するタンパク質を精製した。LC-MS/MS解析により、核酸結合性因子とその関連因子と考えられるタンパク質や機能未知タンパク質を多数同定した。その中から損傷塩基を含むDNAを使用した特に高いスペクトルカウント数を示したタンパク質とその関連因子を抽出した。現在、これら候補タンパク質の配列情報や既知の機能を基に、順次遺伝子クローニングを進めている。一部のタンパク質については大腸菌発現系を用いて組換えタンパク質として高純度に精製できた。生化学的解析から既知の酵素活性を保持していることが分かったので、これから損傷塩基あるいはそれを模倣したDNA基質に対する酵素活性を調べる予定である。損傷塩基を含むDNAを用いたスクリーニングと並行して、真核生物型ヌクレオチド除去修復関連因子XPBの古細菌型オルソログの機能解析も進めている。T. kodakarensis抽出液に存在するXPB相互作用タンパク質を、抗XPB抗体と組換えXPBを用いて回収した試料をLC-MS/MS解析した結果から、T. kodakarensis XPBに結合する可能性のあるタンパク質を同定することができた。現在、XPBと推定相互作用候補タンパク質との直接結合が検出できるかどうかを調べるため、酵母ツーハイブリッド法を用いた解析を進めている。

这项研究的目的是阐明超疗古细菌所拥有的紫外线损伤修复机制。对特异性结合与UV受损的DNA的蛋白质的全面鉴定。制备了含有生物素化（6-4）光药物的受损和未损害的双链DNA，并从高疗法柯达卡素细胞的提取物中纯化与此结合的蛋白质。 LC-MS/MS分析确定了许多被认为是相关因素以及未知功能蛋白的蛋白质和蛋白质。其中，使用含有损坏碱基的DNA提取具有特别高光谱计数及其相关因素的蛋白质。当前，基因克隆正在基于这些候选蛋白的序列信息和已知功能顺序进行。使用大肠杆菌表达系统可以将某些蛋白质作为重组蛋白纯化至高纯度。生化分析表明，它保留了已知的酶活性，现在我们将研究模拟它们的碱基或DNA底物的酶活性。在使用含有损坏碱基的DNA筛选的同时，还正在进行对真核核苷酸切除与修复相关因子XPB的古细胞直系同源物的功能分析。使用抗XPB抗体和重组XPB回收的样品的LC-MS/MS分析的结果，该样品允许鉴定可以与T. kodakarensis XPB结合的蛋白质。当前，我们正在使用酵母两杂化方法进行分析，以研究XPB和推定相互作用候选蛋白之间是否可以检测到直接结合。

项目成果

アーキア研究から見出された新しいDNA修復因子と機能

考古研究发现新的 DNA 修复因子和功能

• 发表时间: 2022
• 作者: 白石 都