古細菌が持つ独特なヌクレオチド除去修復機構の解明

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本研究は超好熱性古細菌が持つ紫外線損傷修復機構を明らかにすることを目的として進めている。紫外線損傷DNAに特異的に結合するタンパク質の網羅的同定を行った。ビオチン化した(6-4)光産物を含む損傷型と非損傷型の二本鎖DNAを用意し、超好熱性古細菌Thermococcus kodakarensis細胞抽出液からこれに結合するタンパク質を精製した。LC-MS/MS解析により、核酸結合性因子とその関連因子と考えられるタンパク質や機能未知タンパク質を多数同定した。その中から損傷塩基を含むDNAを使用した特に高いスペクトルカウント数を示したタンパク質とその関連因子を抽出した。現在、これら候補タンパク質の配列情報や既知の機能を基に、順次遺伝子クローニングを進めている。一部のタンパク質については大腸菌発現系を用いて組換えタンパク質として高純度に精製できた。生化学的解析から既知の酵素活性を保持していることが分かったので、これから損傷塩基あるいはそれを模倣したDNA基質に対する酵素活性を調べる予定である。損傷塩基を含むDNAを用いたスクリーニングと並行して、真核生物型ヌクレオチド除去修復関連因子XPBの古細菌型オルソログの機能解析も進めている。T. kodakarensis抽出液に存在するXPB相互作用タンパク質を、抗XPB抗体と組換えXPBを用いて回収した試料をLC-MS/MS解析した結果から、T. kodakarensis XPBに結合する可能性のあるタンパク質を同定することができた。現在、XPBと推定相互作用候補タンパク質との直接結合が検出できるかどうかを調べるため、酵母ツーハイブリッド法を用いた解析を進めている。