Structural and Bioelectrochemical analysis of Direct Electron Transfer-type bioelectrocatalysis

直接电子转移型生物电催化的结构和生物电化学分析

• 批准号: 22K14831
• 负责人: 宋和 慶盛
• 金额: $ 2.91万
• 依托单位: Kyoto University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
• 财政年份: 2022
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2022-04-01 至 2025-03-31
• 项目状态: 未结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-22K14831/
• 关键词: 直接電子移動型酵素; フルクトース脱水素酵素; バイオセンサ; クライオ電子顕微鏡; 生物電気化学; 構造生物学; 酵素工学; バイオ電池; 酸化還元酵素; 直接電子移動型酵素電極反応

直接電子移動型酵素電極反応（＝DET型反応）は，酵素と電極のみで構成される理想的な反応系であり，酸化還元酵素の基礎研究から環境に優しい次世代型デバイスに向けた応用研究に至るまで，幅広い分野で注目を集めている．しかし，本反応を実現できる酵素の報告例は少なく，反応機構も解明されていない．そこで本研究では，「生物電気化学と立体構造解析および予測技術を融合させた手法によるDET型反応機構の解明」を目的とする．モデル酵素であるフルクトース脱水素酵素（FDH）の立体構造をクライオ電子顕微鏡観察法を利用し，3.6Åの分解能（PDB 7W2J）で解明した（ChemRxivにPreprint出版済）．さらに，酸化還元状態を制御した条件で，2.5Å（還元型）と2.7Å（酸化型）の分解能まで向上させた．本成果は，キノヘモあるいはフラボヘモタンパク質で報告されているDET型酵素において世界で初めての立体構造解析例である．次に，解明した立体構造に基づきFDHの基質認識機構を考察した．酵素表面を観察し，触媒活性部位であるFADに繋がる明瞭なキャビティーを確認した．ドッキングシミュレーションにより，基質認識に必要なアミノ酸残基を３つ特定できた．また，解明した立体構造を活用し生物電気化学的考察を進めた．酵素内に含まれる６個コファクターの酸化還元電位を利用し，マーカスの理論式によって酵素内電子移動速度定数を評価した．本結果より，触媒活性サブユニット内に存在する[4Fe3S]クラスターから電子伝達サブユニットに存在するヘム3c間の電子移動が律速段階であることが示唆された．また，電極との電子移動を担う電極反応部位を電気化学的に考察した．立体構造から酵素表面の静電ポテンシャルを計算し，正あるいは負に帯電させた電極を用いることで，電子伝達サブユニット内のヘム2cが電極反応部位であることを強く示唆する結果を得た．

直接电子转移酶电反应（= DET型反应）是一个理想的反应系统，仅由酶和电极组成，并且在广泛的领域中吸引了人们的注意，从对氧化还原酶的基础研究到应用于环境友好的下一代设备的研究。但是，很少有报道的酶能够实现这种反应，并且尚未澄清反应机制。因此，本研究的目的是通过使用将生物电性化学与三维结构分析和预测技术相结合的方法“阐明DET型反应机制”。使用冷冻电子显微镜阐明了模型酶果糖脱氢酶（FDH）的三维结构，以解决3.6Å分辨率（PDB 7W2J）（ChemRxiv中发表的预印本）。此外，在受控的氧化 - 雷克斯状态下，分辨率提高到2.5Å（降低）和2.7Å（氧化）。这一发现是世界上第一个在奎诺黑emo或flavohhemo蛋白中报道的DET型酶的构象分析的例子。接下来，我们根据阐明的三维结构检查了FDH的底物识别机制。观察到酶表面，并确认清晰的空腔导致催化活性位点FAD。对接模拟使我们能够识别底物识别所需的三个氨基酸残基。此外，我们使用了阐明的三维结构来进行生物电化学考虑。使用酶内包含的六个辅助因子的氧化还原电位，使用MARCUS的理论公式评估了酶内电子转移速率常数。这些结果表明，催化活性亚基中存在的[4FE3S]簇之间的电子转移与电子传递亚基中存在的血红素3C之间的电子转移是限制步骤。此外，我们已经检查了负责电子转移电极通过电化学的电极反应位点。酶表面的静电电势是根据三维结构计算的，通过使用积极或负电荷的电极，我们获得的结果强烈表明电子传递亚基中的血红素2C是电极反应位点。

项目成果

Structural and Bioelectrochemical Elucidation of Direct Electron Transfer-type Membrane-bound Fructose Dehydrogenase

直接电子转移型膜结合果糖脱氢酶的结构和生物电化学阐明

• DOI: 10.26434/chemrxiv-2022-d7hl9
• 发表时间: 2022
• 期刊: ChemRxiv
• 作者: Suzuki Yohei;Makino Fumiaki;Miyata Tomoko;Tanaka Hideaki;Namba Keiichi;Kano Kenji;Sowa Keisei;Kitazumi Yuki;Shirai Osamu
• 通讯作者: Shirai Osamu

Structural and Bioelectrochemical Study of Direct Electron Transfer-type Membrane-bound Fructose Dehydrogenase

直接电子转移型膜结合果糖脱氢酶的结构和生物电化学研究

• 发表时间: 2022
• 作者: Keisei Sowa;Yohei Suzuki;Kenji Kano;Yuki Kitazumi;and Osamu Shirai
• 通讯作者: and Osamu Shirai

京都大学大学院農学研究科応用生命科学専攻生体機能化学研究室HP

京都大学大学院农学研究科应用生命科学系生物功能化学实验室HP