葉緑体を中心とするオルガネラ間コンタクト形成因子の同定と機能評価

以叶绿体为中心的细胞器间接触形成因子的鉴定及功能评价

• 批准号: 22K14865
• 负责人: 中村 咲耶
• 金额: $ 3万
• 依托单位: Institute of Physical and Chemical Research
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
• 财政年份: 2022
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2022-04-01 至 2024-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-22K14865/
• 关键词: コンタクトサイト; split GFP; 葉緑体; オルガネラ; シロイヌナズナ

本研究計画は、植物細胞において異なる細胞内小器官 (オルガネラ) の連携を担うコンタクトサイトに関わる因子として、特に葉緑体を中心としたコンタクトサイトの可視化と機能因子群の同定を進めている。初年度は、split GFP再構成法による各種オルガネラ間コンタクトサイト評価系の構築を行った。まず、すでにsplit GFP再構成法が確立されている酵母や哺乳類細胞で使用実績のあるGFP配列を2分割した不活性断片を、個別に2種のオルガネラの細胞質側に発現させたモデル植物 (シロイヌナズナ、ベンサミアナタバコ) を作出し、共焦点レーザー顕微鏡によるコンタクトサイトの観察を行った。先行して進めた葉緑体-ペルオキシソーム、葉緑体-小胞体の各コンタクトサイトの可視化に成功したが、GFP蛍光が非常に弱いため、植物での使用実績の多い改変型GFP配列でのsplit GFP発現系も用意した。しかしながら蛍光強度の改善は見られなかったため、元のGFP配列を用いた評価系を使用し、他のオルガネラについてもコンストラクト作製を進めた。また、コンタクトサイト機能因子群を同定するため、改変型ビオチンリガーゼ (TurboID) を各オルガネラ膜上に発現させるコンストラクトおよび形質転換植物の作製を進めた。先行して作出した葉緑体外包膜にTurboIDを発現する植物については、近接するタンパク質群の精製、質量分析による同定を行い、葉緑体に近接する他のオルガネラタンパク質の候補を複数同定した。その一部について細胞内局在を調査するため、蛍光タンパク質を融合させた発現コンストラクトを作出した。

This study aims to further the identification of functional factor groups related to the interaction of small intracellular organs in plant cells, especially chloroplasts. In the early years, split GFP reconstruction method was used to construct various kinds of communication systems. The split GFP recombination method was used to establish the expression of GFP in yeast and mammalian cells. The GFP alignment was divided into two inactive fragments. Two kinds of GFP were isolated from the cytoplasm of the cells. The successful visualization of chloroplast-microsome and chloroplast-microsome, GFP fluorescence and plant application results, as well as the split GFP expression system, were discussed in detail. The improvement of the light intensity is due to the use of the GFP alignment evaluation system and the improvement of the operation of the GFP alignment system. The function factor group of the plant is determined, and the change type of the plant (TurboID) is determined. In advance, the chloroplast envelope TurboID is generated, and the plant mass is refined and mass analyzed. In addition, the chloroplast envelope TurboID is generated and mass is selected. A part of the cell's internal structure is investigated, and the light source is fused to the surface.