葉緑体を中心とするオルガネラ間コンタクト形成因子の同定と機能評価

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本研究計画は、植物細胞において異なる細胞内小器官 (オルガネラ) の連携を担うコンタクトサイトに関わる因子として、特に葉緑体を中心としたコンタクトサイトの可視化と機能因子群の同定を進めている。初年度は、split GFP再構成法による各種オルガネラ間コンタクトサイト評価系の構築を行った。まず、すでにsplit GFP再構成法が確立されている酵母や哺乳類細胞で使用実績のあるGFP配列を2分割した不活性断片を、個別に2種のオルガネラの細胞質側に発現させたモデル植物 (シロイヌナズナ、ベンサミアナタバコ) を作出し、共焦点レーザー顕微鏡によるコンタクトサイトの観察を行った。先行して進めた葉緑体-ペルオキシソーム、葉緑体-小胞体の各コンタクトサイトの可視化に成功したが、GFP蛍光が非常に弱いため、植物での使用実績の多い改変型GFP配列でのsplit GFP発現系も用意した。しかしながら蛍光強度の改善は見られなかったため、元のGFP配列を用いた評価系を使用し、他のオルガネラについてもコンストラクト作製を進めた。また、コンタクトサイト機能因子群を同定するため、改変型ビオチンリガーゼ (TurboID) を各オルガネラ膜上に発現させるコンストラクトおよび形質転換植物の作製を進めた。先行して作出した葉緑体外包膜にTurboIDを発現する植物については、近接するタンパク質群の精製、質量分析による同定を行い、葉緑体に近接する他のオルガネラタンパク質の候補を複数同定した。その一部について細胞内局在を調査するため、蛍光タンパク質を融合させた発現コンストラクトを作出した。