葉緑体を中心とするオルガネラ間コンタクト形成因子の同定と機能評価

以叶绿体为中心的细胞器间接触形成因子的鉴定及功能评价

基本信息

批准号：
22K14865
负责人：
中村咲耶
金额：
$ 3万
依托单位：
Institute of Physical and Chemical Research
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
财政年份：
2022
资助国家：
日本
起止时间：
2022-04-01 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-22K14865/
关键词：
コンタクトサイト split GFP 葉緑体オルガネラシロイヌナズナ

项目摘要

本研究計画は、植物細胞において異なる細胞内小器官 (オルガネラ) の連携を担うコンタクトサイトに関わる因子として、特に葉緑体を中心としたコンタクトサイトの可視化と機能因子群の同定を進めている。初年度は、split GFP再構成法による各種オルガネラ間コンタクトサイト評価系の構築を行った。まず、すでにsplit GFP再構成法が確立されている酵母や哺乳類細胞で使用実績のあるGFP配列を2分割した不活性断片を、個別に2種のオルガネラの細胞質側に発現させたモデル植物 (シロイヌナズナ、ベンサミアナタバコ) を作出し、共焦点レーザー顕微鏡によるコンタクトサイトの観察を行った。先行して進めた葉緑体-ペルオキシソーム、葉緑体-小胞体の各コンタクトサイトの可視化に成功したが、GFP蛍光が非常に弱いため、植物での使用実績の多い改変型GFP配列でのsplit GFP発現系も用意した。しかしながら蛍光強度の改善は見られなかったため、元のGFP配列を用いた評価系を使用し、他のオルガネラについてもコンストラクト作製を進めた。また、コンタクトサイト機能因子群を同定するため、改変型ビオチンリガーゼ (TurboID) を各オルガネラ膜上に発現させるコンストラクトおよび形質転換植物の作製を進めた。先行して作出した葉緑体外包膜にTurboIDを発現する植物については、近接するタンパク質群の精製、質量分析による同定を行い、葉緑体に近接する他のオルガネラタンパク質の候補を複数同定した。その一部について細胞内局在を調査するため、蛍光タンパク質を融合させた発現コンストラクトを作出した。

该研究项目是促进接触部位的可视化，尤其是叶绿体的可视化和功能因素的鉴定，这是将植物细胞中不同细胞内细胞器（Organelle）连接的接触位点涉及的因素。在第一年，使用分裂的GFP重建方法构建了各种过类的组织间接触地点评估系统。首先，我们创建了一个模型植物（拟南芥，本塔米亚烟草），其中已经建立了GFP序列的不活性碎片，该序列已经在酵母和哺乳动物细胞中单独使用，该序列已在酵母和哺乳动物细胞中分别使用，并在两个细胞器的细胞质层上使用contered接触站点，并使用confocal sictes confocal lasserserererserersererserser表达。尽管我们成功地看到了叶绿体 - 过敏酶体和叶绿体 - 肾上腺网状网状的接触位点，但我们还使用改良的GFP序列制备了已在植物中使用的分裂GFP表达系统，因为GFP荧光非常弱。但是，未观察到荧光强度的改善，并且还使用原始GFP序列进行了评估系统，也对其他细胞器进行了构造。此外，为了鉴定接触局的功能因素，我们开始准备构造和转化植物，用于在每个细胞器膜上表达改良的生物素连接酶（涡轮）。对于在先前产生的外绿色膜外膜上表达涡轮增压的植物，纯化了相邻的蛋白质基团，并通过质谱法鉴定出相邻的蛋白质基团，并鉴定出接近叶绿体的多种候选细胞器蛋白。为了研究其中一些的亚细胞定位，使用荧光蛋白融合创建了表达构建体。