ゲノム編集技術を用いたインフルエンザウイルス抵抗性ニワトリの作製に向けた研究

インフルエンザウイルス抵抗性を示すニワトリの作出にあたり、本年度の研究ではウイルス耐性遺伝子候補の取得を目的としたCRISPR-Cas9を用いたスクリーニングを行うためのシステムを構築した。ニワトリ遺伝子を対象としたCRISPR-Cas9 gRNAライブラリは存在したいため、まずgRNAライブラリの構築を試みた。データベース上にアノテーションが存在する14000種類のニワトリ遺伝子のタンパク質コード領域を対象とし、各遺伝子に対してCRISPR-Cas9 gRNAの標的配列をそれぞれ6つずつin silicoで設計した。次いでこれら標的配列をカスタムマイクロアレイ上に合成し、PCRにより二重鎖DNAへリカバリーした後gRNA発現用レンチウイルスベクターへとクローニングを行うことでgRNAライブラリを作製した。また、並行してインフルエンザウイルスの感染実験に用いるニワトリ線維芽細胞DF1に対して、piggyBacトランスポゾンベクターを用いて恒常的もしくはテトラサイクリン依存的にCas9タンパク質を発現する安定発現株の樹立を行った。さらに作製した安定発現株をクローン化し、Cas9によるゲノム編集効率が高い株を選抜した。今後これらの材料を用いてインフルエンザウイルス耐性遺伝子のスクリーニングを進める予定である。本研究は世界で初めてニワトリの全遺伝子を対象としたgRNAライブラリを作製した。ニワトリは食肉や食用卵の生産に重要な家禽であり、また鳥類モデル生物として発生学などの基礎生物学においても広く用いられている。本研究で作製したgRNAライブラリは育種や発生学を目的としたCRISPRスクリーニングにも適応可能であり、したがって遺伝子工学的ツールとしても汎用性の高い有益なものだと考えらえる。

インフルエンザウイルス抵抗性を示すニワトリの作出にあたり、本年度の研究ではウイルス耐性遺伝子候補の取得を目的としたCRISPR-Cas9を用いたスクリーニングを行うためのシステムを構築した。ニワトリ遺伝子を対象としたCRISPR-Cas9 gRNAライブラリは存在したいため、まずgRNAライブラリの構築を試みた。データベース上にアノテーションが存在する14000種類のニワトリ遺伝子のタンパク質コード領域を対象とし、各遺伝子に対してCRISPR-Cas9 gRNAの標的配列をそれぞれ6つずつin silicoで設計した。次いでこれら標的配列をカスタムマイクロアレイ上に合成し、PCRにより二重鎖DNAへリカバリーした後gRNA発現用レンチウイルスベクターへとクローニングを行うことでgRNAライブラリを作製した。また、並行してインフルエンザウイルスの感染実験に用いるニワトリ線維芽細胞DF1に対して、piggyBacトランスポゾンベクターを用いて恒常的もしくはテトラサイクリン依存的にCas9タンパク質を発現する安定発現株の樹立を行った。さらに作製した安定発現株をクローン化し、Cas9によるゲノム編集効率が高い株を選抜した。今後これらの材料を用いてインフルエンザウイルス耐性遺伝子のスクリーニングを進める予定である。本研究は世界で初めてニワトリの全遺伝子を対象としたgRNAライブラリを作製した。ニワトリは食肉や食用卵の生産に重要な家禽であり、また鳥類モデル生物として発生学などの基礎生物学においても広く用いられている。本研究で作製したgRNAライブラリは育種や発生学を目的としたCRISPRスクリーニングにも適応可能であり、したがって遺伝子工学的ツールとしても汎用性の高い有益なものだと考えらえる。