がん遺伝子産物RasのGTP加水分解に伴うアロステリック構造変化の解明

阐明与癌基因产物 Ras 的 GTP 水解相关的变构结构变化

• 批准号: 22K15048
• 负责人: 槇野 義輝
• 金额: $ 3万
• 依托单位: Kobe University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
• 财政年份: 2022
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2022-04-01 至 2025-03-31
• 项目状态: 未结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-22K15048/
• 关键词: NMR; Ras蛋白質; 構造生命科学; 創薬科学; SACLA/SPring-8

がん遺伝子産物RASは低分子量G蛋白質であり、細胞内においてGTP結合型（活性型）とGDP結合型（不活性型）を相互変換しながら、標的分子の結合・解離を介して、細胞の増殖、分化、細胞死などの細胞内シグナル伝達を制御している。本研究では、RASのGTP加水分解反応機構、すなわち不活化メカニズムに着目をし、光制御可能なcagedGTP並びに光スイッチング可能なフォトクロミックGTPを駆使し、GTP加水分解過程で生じるアロステリックな構造変化と活性制御メカニズムをNMR分光法、時分割X線結晶構造解析等を用いて原子分解能レベルで解明することを目的としている。2022年度においてはNPE-cagedGTP/RASを用いた時分割X線結晶構造解析の結果からGTP加水分解反応におけるアミノ酸残基の運動性をトレースすることで、その構造伝播はα3/α4ヘリックスの構造変化がトリガーであることが明らかとなった。加えて15N/13C HSQC NMRスペクトルの経時変化をトレースし、その詳細な速度論解析を実施した。その結果GTP加水分解反応はGTP結合領域であるポケット領域において、ポケットが開いたState1からポケットの閉じたState2を経てGDP型へと至る逐次反応であり、GTP加水分解反応の開始からおよそ40min.でState2の割合が極大となり、且つState2の崩壊速度が速く、NMR並びに時分割X線結晶構造解析では補足困難であることが示唆された。そこで、本研究課題の目的の一つであるフォトクロミックGTPの活用の重要性を再認識するに至り、アゾベンゼン結合GTPの合成を外注にて実施し、合成経路を確立した。現在当該GTPをインサートしたRASを用いたNMR測定等を実施し、その光反応性を検証している最中にあり、次年度以降State2を経由するRASの不活化メカニズムの詳細を解明する。

RAS low molecular weight G protein is a protein that converts between GTP binding (active) and GDP-binding (inactive) forms in cells, mediates binding and dissociation of target molecules, and controls cell proliferation, differentiation, and cell death. In this study, the GTP hydrolysis reaction mechanism of RAS, the inactivation mechanism of RAS, the photocontrol mechanism of RAS, the GTP, the photocontrol mechanism of RAS, the GTP hydrolysis process, the photocontrol mechanism of RAS, the GTP, the photocontrol mechanism of RAS, the photocontrol mechanism of RAS, the photocontrol mechanism of RAS, In 2022, the results of time-division X-ray crystal structure analysis of NPE-caged GTP/RAS were analyzed. The structural transformation of α3/α4 was analyzed. 15N/13C HSQC NMR is used to analyze the velocity of the sample. GTP hydration reaction starts at 40min. GTP hydrolysis reaction starts at 40min. The purpose of this study is to re-recognize the importance of GTP utilization and to establish a synthetic pathway for GTP synthesis. Now, when the GTP is activated by RAS, NMR measurements are performed, optical reflectivity is detected, and the details of RAS deactivation are explained in detail in the following year.

项目成果

SACLA/SPring-8/NMRを駆使した低分子量G蛋白質Rasの不活性化機構におけるアロステリック構造変化の解明

使用 SACLA/SPring-8/NMR 阐明低分子量 G 蛋白 Ras 失活机制中的变构结构变化

• 发表时间: 2022
• 作者: 槇野義輝;河村高志;吉川陽子;南後恵理子;熊坂崇;島扶美
• 通讯作者: 島扶美

河村高志, 槇野義輝, 長谷川和也, 吉川陽子, 島扶美, 熊坂崇

河村隆、牧野喜辉、长谷川和也、吉川洋子、岛文、熊坂隆

• 发表时间: 2022
• 作者: 槇野義輝;河村高志;吉川陽子;南後恵理子;熊坂崇;島扶美;低分子量Gタンパク質H-Rasのフリーズトラップ結晶構造解析によるGTPase活性分子メカニズムの追跡
• 通讯作者: 低分子量Gタンパク質H-Rasのフリーズトラップ結晶構造解析によるGTPase活性分子メカニズムの追跡