がん遺伝子産物RasのGTP加水分解に伴うアロステリック構造変化の解明

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がん遺伝子産物RASは低分子量G蛋白質であり、細胞内においてGTP結合型（活性型）とGDP結合型（不活性型）を相互変換しながら、標的分子の結合・解離を介して、細胞の増殖、分化、細胞死などの細胞内シグナル伝達を制御している。本研究では、RASのGTP加水分解反応機構、すなわち不活化メカニズムに着目をし、光制御可能なcagedGTP並びに光スイッチング可能なフォトクロミックGTPを駆使し、GTP加水分解過程で生じるアロステリックな構造変化と活性制御メカニズムをNMR分光法、時分割X線結晶構造解析等を用いて原子分解能レベルで解明することを目的としている。2022年度においてはNPE-cagedGTP/RASを用いた時分割X線結晶構造解析の結果からGTP加水分解反応におけるアミノ酸残基の運動性をトレースすることで、その構造伝播はα3/α4ヘリックスの構造変化がトリガーであることが明らかとなった。加えて15N/13C HSQC NMRスペクトルの経時変化をトレースし、その詳細な速度論解析を実施した。その結果GTP加水分解反応はGTP結合領域であるポケット領域において、ポケットが開いたState1からポケットの閉じたState2を経てGDP型へと至る逐次反応であり、GTP加水分解反応の開始からおよそ40min.でState2の割合が極大となり、且つState2の崩壊速度が速く、NMR並びに時分割X線結晶構造解析では補足困難であることが示唆された。そこで、本研究課題の目的の一つであるフォトクロミックGTPの活用の重要性を再認識するに至り、アゾベンゼン結合GTPの合成を外注にて実施し、合成経路を確立した。現在当該GTPをインサートしたRASを用いたNMR測定等を実施し、その光反応性を検証している最中にあり、次年度以降State2を経由するRASの不活化メカニズムの詳細を解明する。