酵母O-結合型糖鎖の代謝機構解明に向けた新規エンドO-マンノシダーゼの同定

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真核生物のO-結合型糖鎖は、タンパク質のSer/Thr残基を修飾する糖鎖であり、様々な生体内プロセスに深く関わっていることが知られている。近年、その生合成経路については解明されつつあるが、その代謝系についてはほとんど知られていない。その中でもヒトから酵母までその存在が知られているO-マンノース型(OM)糖鎖の代謝機構の知見は全ての生物種で皆無である。それに対し当研究室では、出芽酵母においてタンパク質に付加されたOM糖鎖を切断・遊離させる新規の“エンド-O-マンノシダーゼ(EOMase)”様の酵素活性を発見した。そこで、本研究ではこのEOMase遺伝子および酵素の同定を行い、それらの機能解析を行うことで、O-結合型糖鎖代謝機構の解明を目的とした。本目的に対し、初めに「実験１.EOMase活性検出アッセイ方法の確立」と「実験2.遺伝子破壊株の遊離糖鎖解析によるEOMase遺伝子探索」の二つを試みている。「実験1」では、EOMaseの酵素活を直接的に観察するために、異なる構造を持つ三種類の基質を合成していただいた。本基質を活用し、HPLCでの活性検出の条件、および酵母細胞ライセートを用いた酵素活性検出の条件の検討を行った。その結果、HPLCの条件検討は完了したため、酵素活性検出の条件検討を行っている。「実験2」では、EOMase遺伝子の破壊によって遊離糖鎖が生産されないことが予想されたことから、昨年度までで非必須遺伝子約5000遺伝子中1041遺伝子の破壊株で解析を行った。その結果、EOMase遺伝子の同定には至っていないが、野生株に比べて極端に遊離OM糖鎖生成量が少ない二つの株を見出した。