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酵母O-結合型糖鎖の代謝機構解明に向けた新規エンドO-マンノシダーゼの同定

鉴定一种新型内切-O-甘露糖苷酶，用于阐明酵母 O-连接糖链的代谢机制

基本信息

批准号：
22K15066
负责人：
小山亮祐
金额：
$ 3万
依托单位：
Institute of Physical and Chemical Research
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
财政年份：
2022
资助国家：
日本
起止时间：
2022-04-01 至 2027-03-31
项目状态：
未结题

项目摘要

真核生物のO-結合型糖鎖は、タンパク質のSer/Thr残基を修飾する糖鎖であり、様々な生体内プロセスに深く関わっていることが知られている。近年、その生合成経路については解明されつつあるが、その代謝系についてはほとんど知られていない。その中でもヒトから酵母までその存在が知られているO-マンノース型(OM)糖鎖の代謝機構の知見は全ての生物種で皆無である。それに対し当研究室では、出芽酵母においてタンパク質に付加されたOM糖鎖を切断・遊離させる新規の“エンド-O-マンノシダーゼ(EOMase)”様の酵素活性を発見した。そこで、本研究ではこのEOMase遺伝子および酵素の同定を行い、それらの機能解析を行うことで、O-結合型糖鎖代謝機構の解明を目的とした。本目的に対し、初めに「実験１.EOMase活性検出アッセイ方法の確立」と「実験2.遺伝子破壊株の遊離糖鎖解析によるEOMase遺伝子探索」の二つを試みている。「実験1」では、EOMaseの酵素活を直接的に観察するために、異なる構造を持つ三種類の基質を合成していただいた。本基質を活用し、HPLCでの活性検出の条件、および酵母細胞ライセートを用いた酵素活性検出の条件の検討を行った。その結果、HPLCの条件検討は完了したため、酵素活性検出の条件検討を行っている。「実験2」では、EOMase遺伝子の破壊によって遊離糖鎖が生産されないことが予想されたことから、昨年度までで非必須遺伝子約5000遺伝子中1041遺伝子の破壊株で解析を行った。その結果、EOMase遺伝子の同定には至っていないが、野生株に比べて極端に遊離OM糖鎖生成量が少ない二つの株を見出した。

In eukaryotes, Ser/Thr residues were modified by the combination of glycosaminoglycans and oligodeoxynucleotides. In vivo tests were carried out in vivo. In recent years, in recent years, the synthetic system has been widely used in the field of science and technology. It is known that all kinds of biological species are widely used in all kinds of organisms in the world. It is known that there are many kinds of yeast in the whole world. There are many kinds of yeast in the world. There is a lot of knowledge that all kinds of sugar (OM) are not available in all biological species. In the laboratory, the budding yeast was used in the laboratory, and the OM sugar was cut off. The enzyme activity was not detected in the new regulations. (EOMase). In this study, we were able to analyze the enzyme activity of the EOMase enzyme in the same bank, analyze the enzyme in the bank, and explain the purpose of the O-combined glucose replacement machine. The purpose of this paper is to determine the activity of 1.EOMase in the first place. The analysis of the sugar-isolated plant of the broken plant, the EOMase seed, the exploration of the seed, the broken plant, the sugar isolation, the analysis, the analysis. Three kinds of basic chemicals are synthesized by direct monitoring, EOMase enzyme activity, and so on. In this paper, the conditions for active use, HPLC activity, yeast cell activity, enzyme activity and enzyme activity were used. The results showed that the HPLC condition had finished, and the enzyme activity had been determined. In the first half of this year, 1041 of the 5000 children in the EOMase market were not required for the first time, and 1041 of the total number of strains in the whole population were analyzed. The results showed that the production of OM glycogen in wild plants was less than that in wild plants, and that the production of OM sugar in wild plants was less than that in wild plants.