DNAナノ構造体上を走るモータータンパク質の設計原理の探求

探索在 DNA 纳米结构上运行的运动蛋白的设计原理

基本信息

批准号：
22K15079
负责人：
指宿良太
金额：
$ 3万
依托单位：
National Institute of Information and Communications Technology
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
财政年份：
2022
资助国家：
日本
起止时间：
2022-04-01 至 2023-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

本研究は、細胞骨格系繊維状を歩行するタンパク質モーターを改変し、DNAナノ構造体上を歩行する新規タンパク質モーターを創ることで、分子モーターに共通した一方向性運動の発生原理の理解を深めることを目的としている。これまでに、自然界に存在すダイニンと呼ばれる分子モーターの微小管結合部位を、転写因子といったDNA結合タンパク質と置き換え、フィラメント側であるDNAには、微小管やアクチンと類似した中空状の構造を持ち、結合部位である認識配列を周期的に配置可能なDNAナノチューブと呼ばれる構造体を選択したことで、新規分子モーターがDNAナノチューブ上を一方向に歩行する新規分子モーターシステムの開発に成功している。作製した新規分子モーターは約20種類程度あり、そのうち異なる運動速度を示す11種類のモーターを得た。これらの運動特性の違いが何に起因しているのかを調べるためには、ATPase測定や結合親和性測定などを詳細に調べる必要がある。しかし、多種類あるモーターそれぞれの溶液条件や変異を導入したDNAナノチューブなどの実験条件を考えると、実験量が大幅に増加してしまうため、自動分注機やプレートリーダーなどを用いたハイスループット測定の構築を行った。結果として、一回の実験で4種類の分子モーターを20条件の異なるATP濃度でATPase測定が可能な実験系を構築した。これにより従来1日から2日かかる実験が3時間程度まで短縮することができた。さらに、全反射照明蛍光顕微鏡を用いた運動測定では、1種類のモーターを一時間程度観察するため非常に時間がかかっていたが、384ガラスウェルプレートと自動分注機を用いることで、多数のモーターの運動測定に必要な作業を同時並行に行うことが可能な実験系の構築を現在行っている。

这项研究旨在通过修改在纤维细胞骨架系统中行走的蛋白质电动机，并创建一种在DNA纳米结构上行走的新型蛋白电机，从而加深我们对分子电动机共有的单向运动产生原理的理解。到目前为止，我们已经用DNA结合蛋白（例如转录因子）替换了称为动蛋白的分子发动机的微管结合位点，并选择了一种称为DNA纳米管的结构，具有类似于微管和肌动蛋白的空心结构，并允许在识别的识别序列中，可以定期进行摩擦，并具有新的识别序列，并且已定期地构成了一个新的MOCTIRECTIONT，并具有新的型号的动态，并具有新的型号。在DNA纳米管上。大约有20个新的分子电动机，其中11个显示出不同的运动速度。为了研究这些运动特征上这些差异的原因是什么，有必要详细研究ATPase测量和结合亲和力测量。但是，考虑到每个电动机和实验条件的溶液条件，例如已通过突变引入的DNA纳米管，实验量显着增加，因此使用自动分配器或板读取器构建了高通量测量值。结果，构建了一个实验系统，该系统允许在一个实验中在不同ATP浓度下在不同的ATP浓度下进行ATPase测量。这使得先前花费1到2天的实验将减少到大约3小时。此外，使用完全反射的照明荧光显微镜进行运动测量需要很长时间才能观察一种类型的电动机大约一个小时，但是通过使用384玻璃井板和一个自动分配器，我们目前正在构建一个实验系统，该系统允许同时测量许多运动的运动所需的任务。