In situ observation of intracellular RAS activation and elucidation of its structural basis by in-cell NMR

通过细胞内 NMR 原位观察细胞内 RAS 激活并阐明其结构基础

• 批准号: 22K15068
• 负责人: 趙 慶慈
• 金额: $ 3万
• 依托单位: Chiba University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
• 财政年份: 2022
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2022-04-01 至 2024-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-22K15068/
• 关键词: in-cell NMR; 核磁気共鳴法; 翻訳後修飾; シグナル伝達; 低分子量GTPase

RASタンパク質は細胞内で翻訳後、脂質修飾により細胞膜に局在することで、細胞外刺激に応じて細胞増殖などに関わるシグナル伝達経路を活性化する分子スイッチであり、がん創薬の重要な標的分子である。本研究ではin-cell NMR法(細胞内NMR法)を用いて生きた細胞膜上に局在したRASの構造状態をリアルタイムで解析することにより上流刺激によるRASの活性化を定量的に捉えるとともに、RASの活性化に関与する細胞内の相互作用を明らかにすることを目指す。本年度は脂質修飾に必要なC末端部を含む全長RAS(KRAS4B)を大腸菌発現系で調製し、調製したRASが脂質修飾酵素FTaseによって脂質修飾が進行することを質量分析によって確認した。次にGFPと融合させたRASを調製し、SLO法によって細胞内に導入すると、脂質修飾部位(C185)依存的に細胞膜へ経時的に局在していくことが共焦点レーザー顕微鏡によって観測した。次に安定同位体標識RASをSLO法により細胞内に導入してNMRサンプル管に封入後バイオリアクターシステムにより培地を灌流しながらin-cell NMR測定により細胞内RASのNMRスペクトルを連続的に取得した。その結果、細胞内RASのIle由来のNMRシグナル強度が測定直後から経時的な減少を示し、細胞内に導入したRASが内在性の脂質修飾酵素によってを修飾を受けることによって細胞膜との相互作用が経時的に増大していることが示唆された。今後は、フッ素原子の導入やパルスシーケンスの改良などよりシグナル感度を向上することでin-cell NMR測定の時間分解能の向上させることを検討するとともに、RAS活性型割合の経時変化からシグナル伝達を介したRASの活性化の観測、各種シグナル伝達阻害剤の効果を定量的に評価する手法の確立を目指す。

RAS是一种细胞内修复的新方法，它要求细胞膜局在修复细胞膜，并在体外刺激细胞增殖，使细胞发现新的蛋白质，使其具有更高的活性，使其具有更高的分子量。本研究采用体外细胞内核磁共振法（细胞内核磁共振法），利用体外生小牛胸腺细胞膜上局在小牛RAS诱导形成的诱导因子，解析小牛胸腺细胞的诱导因子要求上流刺激小牛RAS活化定量的小牛胸腺细胞，RAS活化的小牛胸腺细胞与小牛胸腺细胞内的相互作用，阐明了小牛胸腺细胞的诱导因子。本年度骨质疏松症患者必须对C末端部含全氟辛烷磺酸RAS（KRAS4B）的大肠杆菌群进行筛选，并对筛选出的RAS骨质疏松症患者进行FTase纤维蛋白酶定量分析。次GFP融合瘤细胞RAS融合瘤，SLO法修复正常细胞内转染瘤细胞，依赖于修复修复部分（C185）脂存的癌细胞膜增殖的局灶性在正常细胞核共刺激点微球蛋白微球蛋白的形成。次确定相同体标RAS SLO法细胞内进入iii-NMRン尔格管密封进入后BARリアアTA ーシスク地灌流iii-cell NMR确定细胞内RASイのNMR取得的。因此，细胞内RAS是由于核磁共振氢质子化程度的测定直接导致磷脂酰肌醇的减少而显示的，细胞内掺入磷脂酰肌醇RAS的内源性磷脂酰肌醇修饰受磷脂酰肌醇修饰的细胞膜间相互作用的磷脂酰肌醇修饰显示的。氢化物，氢化物元素原子团进入氢氧化物还原反应中改善氢氧化物性质的要求，氢化物原子团的灵敏度对上氢氧化物还原反应的单元内NMR测定，氢化物原子团分解能对上氢氧化物还原反应的单元内NMR测定，RAS各活性型复合氧化物还原反应的介导，RAS各活性型复合氧化物还原反应的介导。

项目成果

In-cell NMR法を用いた動的構造解析によるRac1の細胞内活性制御機構の解明

利用细胞内NMR方法进行动态结构分析，阐明Rac1的细胞内活性调节机制

• 发表时间: 2023
• 作者: Keiji Cho (Qingci Zhao);Katsuhiro Donai;Wataru Kobayashi;Yuki Toyama; Takumi Ueda;Koh Takeuchi;Ichio Shimada;Noritaka Nishida
• 通讯作者: Noritaka Nishida

Real-Time In-Cell NMR Reveals the Intracellular Modulation of GTP-Bound Levels of RAS

• DOI: 10.1016/j.celrep.2020.108074
• 发表时间: 2020-08-25
• 期刊: CELL REPORTS
• 影响因子: 8.8
• 作者: Zhao, Qingci;Fujimiya, Ryu;Nishida, Noritaka
• 通讯作者: Nishida, Noritaka