In situ observation of intracellular RAS activation and elucidation of its structural basis by in-cell NMR

RASタンパク質は細胞内で翻訳後、脂質修飾により細胞膜に局在することで、細胞外刺激に応じて細胞増殖などに関わるシグナル伝達経路を活性化する分子スイッチであり、がん創薬の重要な標的分子である。本研究ではin-cell NMR法(細胞内NMR法)を用いて生きた細胞膜上に局在したRASの構造状態をリアルタイムで解析することにより上流刺激によるRASの活性化を定量的に捉えるとともに、RASの活性化に関与する細胞内の相互作用を明らかにすることを目指す。本年度は脂質修飾に必要なC末端部を含む全長RAS(KRAS4B)を大腸菌発現系で調製し、調製したRASが脂質修飾酵素FTaseによって脂質修飾が進行することを質量分析によって確認した。次にGFPと融合させたRASを調製し、SLO法によって細胞内に導入すると、脂質修飾部位(C185)依存的に細胞膜へ経時的に局在していくことが共焦点レーザー顕微鏡によって観測した。次に安定同位体標識RASをSLO法により細胞内に導入してNMRサンプル管に封入後バイオリアクターシステムにより培地を灌流しながらin-cell NMR測定により細胞内RASのNMRスペクトルを連続的に取得した。その結果、細胞内RASのIle由来のNMRシグナル強度が測定直後から経時的な減少を示し、細胞内に導入したRASが内在性の脂質修飾酵素によってを修飾を受けることによって細胞膜との相互作用が経時的に増大していることが示唆された。今後は、フッ素原子の導入やパルスシーケンスの改良などよりシグナル感度を向上することでin-cell NMR測定の時間分解能の向上させることを検討するとともに、RAS活性型割合の経時変化からシグナル伝達を介したRASの活性化の観測、各種シグナル伝達阻害剤の効果を定量的に評価する手法の確立を目指す。

RASタンパク質は細胞内で翻訳後、脂質修飾により細胞膜に局在することで、細胞外刺激に応じて細胞増殖などに関わるシグナル伝達経路を活性化する分子スイッチであり、がん創薬の重要な標的分子である。本研究ではin-cell NMR法(細胞内NMR法)を用いて生きた細胞膜上に局在したRASの構造状態をリアルタイムで解析することにより上流刺激によるRASの活性化を定量的に捉えるとともに、RASの活性化に関与する細胞内の相互作用を明らかにすることを目指す。本年度は脂質修飾に必要なC末端部を含む全長RAS(KRAS4B)を大腸菌発現系で調製し、調製したRASが脂質修飾酵素FTaseによって脂質修飾が進行することを質量分析によって確認した。次にGFPと融合させたRASを調製し、SLO法によって細胞内に導入すると、脂質修飾部位(C185)依存的に細胞膜へ経時的に局在していくことが共焦点レーザー顕微鏡によって観測した。次に安定同位体標識RASをSLO法により細胞内に導入してNMRサンプル管に封入後バイオリアクターシステムにより培地を灌流しながらin-cell NMR測定により細胞内RASのNMRスペクトルを連続的に取得した。その結果、細胞内RASのIle由来のNMRシグナル強度が測定直後から経時的な減少を示し、細胞内に導入したRASが内在性の脂質修飾酵素によってを修飾を受けることによって細胞膜との相互作用が経時的に増大していることが示唆された。今後は、フッ素原子の導入やパルスシーケンスの改良などよりシグナル感度を向上することでin-cell NMR測定の時間分解能の向上させることを検討するとともに、RAS活性型割合の経時変化からシグナル伝達を介したRASの活性化の観測、各種シグナル伝達阻害剤の効果を定量的に評価する手法の確立を目指す。