蛍光イメージングによる時空間的なゲノムインプリンティング制御機構の解明

利用荧光成像阐明时空基因组印记控制机制

• 批准号: 22K15084
• 负责人: 大石 裕晃
• 金额: $ 2.91万
• 依托单位: Kyushu University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
• 财政年份: 2022
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2022-04-01 至 2025-03-31
• 项目状态: 未结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-22K15084/
• 关键词: RNA-seqFISH; インプリント遺伝子の転写動態; 転写バースト; ゲノム刷り込み; ライブイメージング; 高次ゲノム構造; 多様性; DNAメチル化

ゲノム刷り込み(ゲノムインプリンティング)領域における時空間的な転写制御機構の研究を行うために、該当領域の可視化のためのプローブ設計およびその予備検証を実施した。まず特定のゲノム領域を5kbの区画に分画し、その領域に対応する最適なDNA配列を抽出した。この分画に対して、最小で20個以上の配列が割り当てられたものを解析対象として採用した。次にこれらの区画ごとで区別するための読み取り配列を付加した。さらに対象領域の遺伝子の転写を可視化するためにイントロン領域に同様のプローブの設計を行なった。これらの配列を用いて、一分子FISH法によってプローブの有用性を検証した。結果として、マウスES細胞においてインプリントを受けるMeg3やH19が片アレルから発現していることを確認した。一方ですべての細胞が片アレルから発現しているわけではなく、両アレルや全く発現していない細胞も観察された。転写バーストによって遺伝子の活性と静止状態が動的に変化している可能性がある。今後は、標的領域のプローブを用いたゲノム相互作用を含む空間配置情報や生細胞を用いた動態解析を行なうことでインプリント遺伝子の転写動態制御機構に迫る予定である。さらにプローブの検出感度を向上させるために、短鎖ヘアピンDNAを用いたHCR FISH法をseqFISH法に応用したHCR seqFISH法を確立した。この方法を用いることでプローブ数を4分の1程度に減らすことが可能になった。対象領域の拡大や検出効率の向上が見込んでいる。また転写動態の派生研究において転写動態を正確かつ簡便に観察可能な技術を開発し、当該内容を2022年12月Nature communications誌に発表した。

为了研究基因组烙印区域中的时空转录控制机制，我们进行了探针设计，以可视化相关区域及其初步验证。首先，将特定的基因组区域分级为5KB隔室，并提取了与该区域相对应的最佳DNA序列。对于此部分，至少将20个或更多序列分配给分析。然后添加读取序列以区分这些隔室。此外，在内含子区域设计了类似的探针，以可视化感兴趣区域中基因的转录。使用这些序列，通过单分子鱼法验证了探针的有用性。结果，已经证实，印有小鼠ES细胞中的MEG3和H19是用一个等位基因表达的。另一方面，并​​非所有细胞都从一个等位基因表达，并且都没有观察到等位基因。转录爆发可能导致基因活性和静态状态的动态变化。将来，我们计划通过执行空间排列信息，包括使用目标区域探针和使用活细胞的动态分析（包括基因组相互作用），以更接近烙印基因的转录动力学控制机制。此外，为了提高探针的检测灵敏度，建立了HCR Seq鱼方法，其中将使用短链发夹DNA的HCR鱼方法应用于SeqFish方法。使用此方法，将探针数量减少大约四分之一。预计目标区域将扩大，并提高检测效率。此外，在转录动力学衍生研究研究的研究中，开发了一种允许对转录动力学进行准确和方便观察的技术，并且内容发表在2022年12月的《自然通信》杂志上。

项目成果

STREAMING-Tag System: Technology to Enable Visualization of Transcriptional Activity and Subnuclear Localization of Specific Endogenous Genes

STREAMING-Tag 系统：实现特定内源基因转录活性和亚核定位可视化的技术

• DOI: 10.1007/978-1-0716-2724-2_8
• 发表时间: 2022
• 期刊: Methods in molecular biology
• 作者: Ohishi Hiroaki;Ochiai Hiroshi
• 通讯作者: Ochiai Hiroshi

Single-gene imaging elucidates spatiotemporal relationships between transcriptional activity and regulatory factor clustering

单基因成像阐明转录活性和调控因子聚类之间的时空关系

• 发表时间: 2022
• 作者: 大石 裕晃;島田 聖瑠;内野 哲志;Jieru Li;佐藤 優子;新谷 学文;大和田 一志;大川 恭行;Pertsinidis Alexandros;山本 卓;木村 宏;落合 博
• 通讯作者: 落合 博