トランスジェニックから探るアブラムシ細胞内共生系の分子基盤

通过转基因探索蚜虫内共生系统的分子基础

基本信息

批准号：
22K15169
负责人：
依田真一
金额：
$ 2.91万
依托单位：
National Institute for Basic Biology
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
财政年份：
2022
资助国家：
日本
起止时间：
2022-04-01 至 2025-03-31
项目状态：
未结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-22K15169/
关键词：
アブラムシ細胞内共生遺伝子導入 piggyBac 共生トランスジェニック

项目摘要

今年度はエンドウヒゲナガアブラムシにおいてトランスジェニックシステムを確立するために、DNAベクター(piggyBacトランスポゾン) を用いた遺伝子導入法の構築を行った。まず、初期胚で高活性なプロモーター配列を特定するために、蛍光タンパク質上流にプロモーター候補配列を挿入したdonor plasmidを作製し、初期胚にインジェクションした。リアルタイムPCRによって蛍光タンパク質の発現を定量したところ、2種類のプロモーターが初期胚で高活性を示すことがわかった。遺伝子導入個体を作出するために、helperとして改変型piggyBacであるhyper-active piggyBac transposase (hyPBase) を用いてdonor plasmidと一緒に初期胚にインジェクションした。Helperはプラスミド、またはin vitro転写したmRNAとして供給した。その結果、未だ系統化には至っていないものの、発生途中で死亡したG0世代を解析したところ1.4%の割合でモザイク個体が含まれていることがわかった。さらにアブラムシに最適な蛍光タンパク質について検討したところ、アブラムシ卵は緑色の波長域で自家蛍光を発する一方、赤色の波長域では自家蛍光がほとんど見られないことがわかった。そのため、緑色のGFPよりも赤色のDsRedやmCherryなどの蛍光タンパク質の方が遺伝子導入のマーカー遺伝子として適していることが示唆された。アブラムシ卵の孵化率を上げるために、アブラムシ卵へのインジェクション技術についても改良を行った。具体的には、ガラスキャピラリー先端の研磨法と卵のホルマリン処理による防カビ法を確立した。

今年，我们使用DNA载体（Piggybac Transon）构建了一种基因转移方法，以在PEA蚜虫中建立转基因系统。首先，为了鉴定早期胚胎中的高活性启动子序列，用候选启动子序列插入荧光蛋白上游并注入早期胚胎中的候选启动子序列。当通过实时PCR定量荧光蛋白的表达时，发现两个启动子在早期胚胎中表现出很高的活性。为了产生转基因个体，将早期胚胎与供体质粒一起使用改良的Piggybac超活跃的Piggybac转座酶（HYPBase）作为助手。提供助手作为质粒或体外转录mRNA。结果，尽管尚未实现系统的系统，但在暴发中期死亡的G0代人的分析表明，包括1.4％的马赛克个体被包括在内。此外，当我们研究了蚜虫的最佳荧光蛋白时，我们发现蚜虫卵在绿色波长范围内发射自动荧光，而在红色波长范围内几乎看不到自动荧光。因此，已经提出，与绿色GFP相比，红色荧光蛋白（如DSRED和MCHERRY）更适合作为基因转移的标记基因。为了提高蚜虫卵的孵化速率，还提高了蚜虫卵的注射技术。具体而言，已经建立了一种通过抛光玻璃毛细管和处理鸡蛋福尔马林鸡蛋来防止霉菌的方法。