Development of Novel Anti-Allergic Drug Using Strategic IgG Antibody Processing Technology

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単価ハプテンによるマスト細胞活性化抑制機構解明のため、以下の実験を行った。・細胞内Caイオン濃度上昇抑制機構の解明単価ハプテンによる多価抗原刺激後の細胞内Caイオン濃度上昇の抑制が、小胞体からのCaイオンの遊離に影響を及ぼすかどうかを調べるために、mag-fluo4 AMを用いて測定を行った。その結果、単価ハプテンを添加した時点で、小胞体から細胞質へのCaイオンの遊離が停止することが明らかとなった。さらに、Caイオン排出ポンプにも影響を及ぼすかについて調べるために、PMCAの阻害剤のcarboxyeosin、NCK・NCKX阻害剤のKB-R7943を用いて細胞内Caイオン濃度測定を行うための実験系を確立した。・細胞骨格系タンパク質へ及ぼす影響の解明アクチン脱重合に関与するcofilinの活性（リン酸化レベル）を制御することが知られているLIMKinaseとslingshot (ホスファターゼ）に着目して実験を行った。cofilinは多価抗原刺激後１分前後で一時的に脱リン酸化（活性化）することはマスト細胞においても知られているが、多価抗原刺激後のslingshotとLIMKinaseの活性については不明であったため、まず、多価抗原後の各時点におけるリン酸化レベルの変化についてウエスタンブロット法にて検討を行った。その結果刺激１分前後でslingshotは脱リン酸化（活性化）することが確認された。一方で、LIMKは脱リン酸化（不活性化）することが確認され、この不活性化は少なくとも５分後まで持続した。そこで、多価抗原刺激後に単価ハプテンを添加した場合におけるこれらのタンパクへの影響を確認したところ、slingshot、LIMKは迅速にリン酸化されることが明らかとなり、単価ハプテンによりこれらのタンパク質の活性が迅速に変化することでcofilinの活性を制御することが示唆された。