癌細胞特異的に発現するAspHを標的とした難治性癌有効な抗癌剤シード化合物の探索

以癌细胞中特异表达的 AspH 为靶点，寻找治疗难治性癌症的有效抗癌药物种子化合物

基本信息

批准号：
22K15303
负责人：
中嶋優
金额：
$ 2.91万
依托单位：
University of Toyama
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
财政年份：
2022
资助国家：
日本
起止时间：
2022-04-01 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-22K15303/
关键词：
2OG依存性酸化酵素 AspH 阻害剤漢方

项目摘要

富山大学和漢医薬学総合研究所が有する160種類の生薬抽出液および漢方方剤抽出液のライブラリーに対して、AspH阻害活性試験を実施した。構築したアッセイ系は、AspHが酵素反応中に放出するコハク酸を検出することに基づいており、試料中にAspH阻害剤が存在する場合に低下するコハク酸の生成量の検出を目的とする。まず、基質であるEGFD1、共基質である2OGおよび補因子である鉄イオンとアスコルビン酸を使用し、AspHに対する一次反応を実施した。次に、この反応生成物であるコハク酸を、ATPおよびCoAの存在下でSuccinyl-CoA Synthetase（SCS）によってSuccinyl-CoAに変換する二次反応を実施した。最後に、Malachite Green Phosphate Assay Kitを使用して、この反応で放出されたモノリン酸を検出する三次反応を実施した。この反応は、96ウェルプレートを使用した簡易的なスクリーニングに適しており、620 nmの吸光測定によるモノリン酸濃度依存的な検出が可能である。また、EGFD1は最低限のアミノ酸配列から構成される39残基のペプチドとして調製され、異種大腸菌にて大量発現および多段階精製によって高純度化した。同様に、AspHおよびSCSも異種大腸菌にて高純度化した。スクリーニングに使用する各抽出液は1 mg/ml、0.01 mg/ml、0.0001 mg/mlの異なる濃度で評価した。N-oxalylglycine（NOG）はAspHを含めた2OG依存性酸化酵素の共通阻害剤であるため、コントロールとしてNOGを100μMの濃度で使用した。結果として、ビャクシやブクリョウといった生薬、そして人参養栄湯といった漢方方剤抽出液が、濃度によってAspHの阻害活性を示すことが判明した。

ASPH抑制活性测试是在富山大学日本和中药研究所拥有的160种类型的草药提取物和中草医学提取物的图书馆中进行的。构造的测定系统基于酶促反应过程中Asph释放的琥珀酸检测，旨在检测样品中ASPH抑制剂时降低的琥珀酸产生的量。首先，使用底物EGFD1，Co-Substrate 2OG以及辅助铁离子和抗坏血酸进行了针对ASPH的主要反应。然后进行次要反应，其中在ATP和COA存在下，通过琥珀酰辅酶A合成酶（SC）将反应产物琥珀酰-COA转化为琥珀酰辅酶A。最后，使用孔雀石绿色磷酸盐测定试剂盒进行了三级反应，以检测该反应中释放的单磷酸盐。该反应适用于使用96孔板的简单筛选，从而可以通过620 nm的吸收测量值进行单磷酸浓度依赖性检测。此外，EGFD1作为由最小氨基酸序列组成的39个残留肽制备，并通过在异源大肠杆菌和多步纯化中高度纯化。同样，ASPH和SC也用异源大肠杆菌高度纯化。以不同的浓度为1 mg/ml，0.01 mg/ml和0.0001 mg/ml评估用于筛查的每种提取物。由于N-氧甲基甘氨酸（NOG）是包括ASPH在内的2OG依赖性氧化酶的常见抑制剂，因此NOG以100μm的浓度用作对照。结果，发现诸如水母和布库里约（Bukuriyo）等草药以及诸如konanyoeito之类的中草药提取物表现出ASPH的抑制作用，具体取决于浓度。