癌細胞特異的に発現するAspHを標的とした難治性癌有効な抗癌剤シード化合物の探索

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富山大学和漢医薬学総合研究所が有する160種類の生薬抽出液および漢方方剤抽出液のライブラリーに対して、AspH阻害活性試験を実施した。構築したアッセイ系は、AspHが酵素反応中に放出するコハク酸を検出することに基づいており、試料中にAspH阻害剤が存在する場合に低下するコハク酸の生成量の検出を目的とする。まず、基質であるEGFD1、共基質である2OGおよび補因子である鉄イオンとアスコルビン酸を使用し、AspHに対する一次反応を実施した。次に、この反応生成物であるコハク酸を、ATPおよびCoAの存在下でSuccinyl-CoA Synthetase（SCS）によってSuccinyl-CoAに変換する二次反応を実施した。最後に、Malachite Green Phosphate Assay Kitを使用して、この反応で放出されたモノリン酸を検出する三次反応を実施した。この反応は、96ウェルプレートを使用した簡易的なスクリーニングに適しており、620 nmの吸光測定によるモノリン酸濃度依存的な検出が可能である。また、EGFD1は最低限のアミノ酸配列から構成される39残基のペプチドとして調製され、異種大腸菌にて大量発現および多段階精製によって高純度化した。同様に、AspHおよびSCSも異種大腸菌にて高純度化した。スクリーニングに使用する各抽出液は1 mg/ml、0.01 mg/ml、0.0001 mg/mlの異なる濃度で評価した。N-oxalylglycine（NOG）はAspHを含めた2OG依存性酸化酵素の共通阻害剤であるため、コントロールとしてNOGを100μMの濃度で使用した。結果として、ビャクシやブクリョウといった生薬、そして人参養栄湯といった漢方方剤抽出液が、濃度によってAspHの阻害活性を示すことが判明した。