がん関連線維芽細胞に発現するUBL3の非小細胞肺がん増殖・浸潤への寄与検証

验证癌症相关成纤维细胞表达的UBL3对非小细胞肺癌增殖和侵袭的贡献

• 批准号: 22K15525
• 负责人: 高梨 裕典
• 金额: $ 2.33万
• 依托单位: Hamamatsu University School of Medicine
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
• 财政年份: 2022
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2022-04-01 至 2025-03-31
• 项目状态: 未结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-22K15525/
• 关键词: 肺癌; 癌関連繊維芽細胞; UBL3; エクソソーム; がん関連線維芽細胞; 細胞外小胞

当科において肺癌手術を行った患者由来の肺癌組織から癌関連繊維芽細胞株（CAF）と腫瘍細胞株の樹立を試みた。CAF株を樹立する事に成功し凍結保存を行ったが、腫瘍細胞株の樹立は困難であったため、普及している肺腺癌細胞株（A549）および肺大細胞癌細胞株（H1299）で代用する方針とした。CAFは継代を繰り返す事により老化し、表現型が変化しやすいため、まずA549とH1299を用いてUBL3ノックアウトの手法とエクソソーム抽出法を確立する方針とした。A549、H1299にCRISPR/CS9システムを作用させ、ピューロマイシンによる選択後に、それぞれの細胞種においてクローン株を20個ずつ採取した。UBL3に対するウエスタンブロットの条件検討を行い、クローン化した双方の細胞種においてUBL3がノックアウトされた細胞株を複数確認した。採取したUBL3ノックアウト細胞株を増殖させ、培養上清を用いて超遠心法によりエクソソームを回収し、ナノトラッキング法による解析までのシークエンスを確立した。今後、樹立したCAFにおいて同様の手法（CRISPR/CAS9によるUBL3ノックアウト、超遠心法によるエクソソーム抽出）を適用し、UBL3ノックアウトCAF株と親CAF株のエクソソームにおけるプロテオミクス解析を行う予定である。

When the surgery for lung cancer is performed, the origin of lung cancer tissue, cancer-associated fibroblast cell line (CAF) and tumor cell line are established. CAF cell line was successfully established, and tumor cell line was difficult to establish. CAF has established a policy on the use of UBL3 in order to improve the quality of products. A549, H1299 CRISPR/CS9 system function, selection, selection UBL3 is the first cell line to be identified in the study. The culture supernatant of UBL3 cells was cultured and analyzed by ultra-remote method. In the future, establish the same method of CAF (CRISPR/CAS9, UBL3, UBL3, UBL