血流感染症における新規迅速診断法の開発と重症度判定の臨床的有用性の評価

开发一种新的血流感染快速诊断方法并评估其严重程度的临床实用性

• 批准号: 22K15688
• 负责人: 丹野 大樹
• 金额: $ 2.83万
• 依托单位: Fukushima Medical University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
• 财政年份: 2022
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2022-04-01 至 2025-03-31
• 项目状态: 未结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-22K15688/
• 关键词: 血流感染症; 敗血症; デジタルPCR; 迅速診断法開発; 重症度・治療効果判定

敗血症は、医療が発達した現代においても死亡率が30～50%と治療困難な病態であり、「早期診断と早期治療介入」が救命率を改善させる最も効果的な手段とされている。敗血症診断の臨床検査法として敗血症マーカーと血液培養検査の２つが用いられているが、早期診断と早期治療介入が重要な敗血症診断において現状の臨床検査法では不十分といえる。本研究は、第３世代PCRと呼ばれるデジタルPCR技術を用いて、敗血症診断の新たな臨床検査法の開発を目指すことを目的としている。デジタルPCRは微量な核酸検出や細菌の絶対定量が可能であり、本研究により培養前検体からの新たな細菌検出法の確立や血中細菌数を指標とした敗血症の重症度・治療効果判定への応用が期待される。本研究では、デジタルPCRでどの程度微量な核酸検出が可能となるのかが重要になってくる。基礎的検討として、まずTotal bacteria検出用FAM標識probe/primerを用いてデジタルPCRの検出限界を確かめた。初期の検討ではバックグラウンドの蛍光強度が強く（70copies/μL）、微量な核酸検出に干渉し大きな問題となったが、試薬調整や実験手技等の見直し、環境サンプル対応のマスターミックスを用いることでこの問題を解決した。次に、どの程度微量な核酸が検出できるかを、大腸菌ゲノムDNA 1ng, 0.1ng, 0.01ng, 0.001ngの４点で検討した。ネガティブコントロールでも1copies/μL程度はバックグラウンドとして検出されてしまうものの、大腸菌ゲノムDNAが 0.001ngと微量であっても3copies/μL程度検出され、ネガティブコントロールと明確に区別することができた。これらの検討結果から、最適なPCR条件の設定や検出可能な細菌数の把握という初年度の研究計画はおおむね達成できたといえる。

Sepsis は, medical が 発 da し た modern に お い て も が 30 ~ 50% mortality と treatment difficult な pathological で あ り, "early diagnosis と early treatment intervention" を が help rate improve さ せ る most も unseen fruit な means と さ れ て い る. Sepsis in the diagnosis of clinical 検 の check method と し て sepsis マ ー カ ー と blood culture 検 check の 2 つ が with い ら れ て い る が, early diagnostic と early treatment intervention が important な sepsis に お い て status の clinical 検 check method で は not quite と い え る. は this study, the third generation PCR と shout ば れ る デ ジ タ を ル PCR technology with い て, sepsis diagnosis の new た な clinical 検 check method の open 発 を refers す こ と を purpose と し て い る. デ ジ タ ル PCR は trace な nucleic acid 検 out の unique quantitative が seaborne や bacteria could で あ り, this study に よ り training before 検 body か ら の new た な bacteria の 検 out method to establish や number of bacteria in blood を index と し た の sepsis, severe degree of treatment services, fruit determine へ の 応 with が expect さ れ る. This study で は, デ ジ タ ル PCR で ど の degree trace な nucleic acid 検 out が may と な る の か が important に な っ て く る. Basis of beg と 検 し て, ま ず Total bacteria 検 out with the FAM identification the probe/primer を with い て デ ジ タ ル PCR の 検 out limit を か indeed め た. Early の beg で 検 は バ ッ ク グ ラ ウ ン ド の 蛍 light intensity strong が く 70 copies/mu (L), trace な nucleic acid 検 に dry involved し big き な problem と な っ た が, try 薬 adjustment や be 験 manipulation の see straight し, such as environmental サ ン プ ル 応 seaborne の マ ス タ ー ミ ッ ク ス を with い る こ と で こ の を solve し た. に, ど の degree trace な nucleic acid が 検 out で き る か を, coliform ゲ ノ ム DNA 1 ng, 0.1 ng, 0.01 ng, 0.001 ng の 4 で beg し 検 た. ネ ガ テ ィ ブ コ ン ト ロ ー ル で も 1 copies/mu L degree は バ ッ ク グ ラ ウ ン ド と し て 検 out さ れ て し ま う も の の, coliform ゲ ノ ム DNA が 0.001 ng と trace で あ っ て も 3 copies/mu L degree 検 out さ れ, ネ ガ テ ィ ブ コ ン ト ロ ー ル と に clear distinction す る こ と が で き た. こ れ ら の 検 for results か ら set, the optimal な PCR conditions の や 検 makes possible な bacterial count の grasp と い う annual の research project at the beginning of は お お む ね reached で き た と い え る.