Elucidation of ALS pathology caused by disruption of NEK1-mediated cell signaling pathway

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本研究では、孤発性を含む筋萎縮性側索硬化症　(ALS) のリスク遺伝子であるNever in mitosis gene A-related Kinase 1 (NEK1) の翻訳産物であるセリン・スレオニンキナーゼNEK1に着目し、リン酸化の標的となる基質タンパク質を同定した上で、運動ニューロン死というALSの根本的病態に至るカスケードの一旦を解明することを目的としている。今年度は、野生型・変異型NEK1の活性を評価するためのin vitroアッセイの確立と、NEK1欠損/過剰発現SH-SY5Y細胞をサンプルとしてNEK1のリン酸化基質をプロテオミクス技術により探索することを予定していたが、後述の理由により、完了には至っていない。このため、予備的検討において見出されたNEK1の基質タンパク質について、リン酸化の病的意義の解析をすすめる方針に切り替えた。具体的には、ALSの運動ニューロン病理におけるTDP-43の核外移行・凝集体形成などからRNA代謝障害はALSの主要病態と想定されているが、申請者はALS患者で遺伝子変異が報告されている複数のRNA結合タンパク質のリン酸化を検討し、その中にNEK1によってリン酸化されるタンパク質Xがあることを見出した。そのタンパク質Xについて、NEK1によるリン酸化の標的となるコンセンサス配列を含む部位に着目して、リン酸化部位の同定を試みている。また、CRISPR/Cas9を用いてXの遺伝子にALS関連変異をノックインしたSH-SY5Y細胞の作出を行い、NEK1によるリン酸化の程度の違いとその生物学的意義について解析を行った。