MAC感染症におけるエクソソームの役割についての研究

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THP-1細胞を使用予定だったが、購入当初からvaibilityが悪く、PMA刺激を加えてマクロファージへ分化を試みても実際に分化できるのは30%にも届かず、継代によりさらにviabilityが落ちることから、Raw267.4細胞に標的を変更した。aviumに感染したRaw264.7からの上清中のエクソソームを、未感染のRaw264.7細胞に投与した際に、M1/M2マクロファージの分化割合に変化が起こるのかを検証した。6 well palteに2×10^6cellsを播種、24時間後にM.aviumを10MOIの濃度で1時間インキュベートして感染させた。その後無血清のDMEMで3回洗浄し、Exosome free血清で調整したDMEMに変更し、72時間後、上清を回収した。エクソソームは抽出キット（Invitrogen社、Total exosome isolation kit from cell culture media)を用い、100ulPBSに溶解した。control、10MOI、100MOIで実施し、エクソソーム溶解PBSのタンパク濃度をプロテインアッセイで測定したところ、いずれも0.5mg/ml前後で差がなかった。10MOIで感染した際のエクソソーム100ugを2×10^6cellのRaw264.7 cellに投与した。controlおよびエクソソームを投与した細胞を24時間後に回収、染色、固定、透過処理を実施した。染色にはM1としてCD206、M2としてiNOSを用いた。ポジティブコントロールはM1はRaw264.7にLPS 1000ng/ml+IFNγ20ng/mlを、M2はIL-4 20ng/mlを投与して準備した。フローサイトメトリーで各サンプルを検証した。controlと比べ、エクソソームを投与したRaw264.7は、M1にもM2にも分化が見られなかった。