MAC感染症におけるエクソソームの役割についての研究

外泌体在MAC感染中的作用研究

• 批准号: 22K16159
• 负责人: 牧口 友紀
• 金额: $ 2.91万
• 依托单位: Hirosaki University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
• 财政年份: 2022
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2022-04-01 至 2024-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-22K16159/
• 关键词: マクロファージ分化; avium感染マクロファージ; エクソソーム; MAC感染症

THP-1細胞を使用予定だったが、購入当初からvaibilityが悪く、PMA刺激を加えてマクロファージへ分化を試みても実際に分化できるのは30%にも届かず、継代によりさらにviabilityが落ちることから、Raw267.4細胞に標的を変更した。aviumに感染したRaw264.7からの上清中のエクソソームを、未感染のRaw264.7細胞に投与した際に、M1/M2マクロファージの分化割合に変化が起こるのかを検証した。6 well palteに2×10^6cellsを播種、24時間後にM.aviumを10MOIの濃度で1時間インキュベートして感染させた。その後無血清のDMEMで3回洗浄し、Exosome free血清で調整したDMEMに変更し、72時間後、上清を回収した。エクソソームは抽出キット（Invitrogen社、Total exosome isolation kit from cell culture media)を用い、100ulPBSに溶解した。control、10MOI、100MOIで実施し、エクソソーム溶解PBSのタンパク濃度をプロテインアッセイで測定したところ、いずれも0.5mg/ml前後で差がなかった。10MOIで感染した際のエクソソーム100ugを2×10^6cellのRaw264.7 cellに投与した。controlおよびエクソソームを投与した細胞を24時間後に回収、染色、固定、透過処理を実施した。染色にはM1としてCD206、M2としてiNOSを用いた。ポジティブコントロールはM1はRaw264.7にLPS 1000ng/ml+IFNγ20ng/mlを、M2はIL-4 20ng/mlを投与して準備した。フローサイトメトリーで各サンプルを検証した。controlと比べ、エクソソームを投与したRaw264.7は、M1にもM2にも分化が見られなかった。

THP-1 cells were used for a predetermined period of time, and the viability of the cells was increased when the cells were purchased. PMA stimulation was used to increase the viability of THP-1 cells. avium-infected Raw264.7 cells were isolated from the supernatant, and uninfected Raw264.7 cells were isolated from the supernatant. 6 well palette 2 × 10^6 cells sown, 24 hours later M. avium 10 MOI concentration 1 hour later infected After 3 times of serum free DMEM washing, Exosome free serum was adjusted to DMEM, 72 times later, supernatant was recovered. The total exosome isolation kit from cell culture media (Invitrogen) was dissolved in 100ul PBS. control, 10MOI, 100MOI, and the concentration of PBS dissolved in the solution was measured at 0.5mg/ml. 10 MOI After 24 hours, the cells were recovered, stained, fixed, and processed. Color M1 and CD206, M2 and iNOS M1, LPS 1000ng/ml + IFN γ 20ng/ml, M2, IL-4 20ng/ml All kinds of documents are required. control,