TKI投与によるEGFR遺伝子変異陽性肺腺癌の小細胞癌への形質転換に関する研究

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候補となる肺癌細胞株のうちHCC2935については増殖速度が極めて遅く、耐性化の実験に用いるのは現実的ではないと判断した。残りの6細胞株に対して、予備実験ではウエスタンブロットでRb1の発現を確認していたが、免疫細胞染色を行ったところ、H2172 (RB1にpathogenic mutationを有している)以外の5細胞株ではRb1陽性であることが確認された。この5細胞株に対して過去に実験系を確立しているリポフェクションによるプラスミド導入でRB1のノックアウトを複数回試みてサブクローニングを行ったが、RB1がノックアウトしたクローンを得ることができなかった。代替の手段としてCas9タンパクとsingle guide RNAの混合物をエレクトロポレーションで肺癌細胞株PC-9に導入することを試みたところ、免疫細胞染色ではおよそ85%の細胞でRb1発現が消失しており、サブクローニングして得られた10クローンのうち9クローンでRb1の発現消失が確認された。それぞれからDNAを抽出して切断領域の塩基配列を確認したところ、いずれもRB1の配列が1-14塩基欠失していることが確認された。in vivoの実験としては申請者の所属する機関の動物実験倫理委員会にプロトコルを提出して実験開始の承認を得た。ヌードマウスに肺癌細胞株PC-9を皮下注して腫瘍の生着を見る実験系の立ち上げを行った。BALB/c -nu/nuではmatrigelと混合して皮下注したマウスに、BALB/c scidでは細胞株単独で皮下注したマウスに皮下腫瘤の形成が見られた。