TKI投与によるEGFR遺伝子変異陽性肺腺癌の小細胞癌への形質転換に関する研究

EGFR基因突变阳性肺腺癌TKI转化为小细胞癌的研究

基本信息

批准号：
22K16186
负责人：
前村啓太
金额：
$ 2.91万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
财政年份：
2022
资助国家：
日本
起止时间：
2022-04-01 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-22K16186/
关键词：
肺癌 EGFR 肺小細胞癌形質転換

项目摘要

候補となる肺癌細胞株のうちHCC2935については増殖速度が極めて遅く、耐性化の実験に用いるのは現実的ではないと判断した。残りの6細胞株に対して、予備実験ではウエスタンブロットでRb1の発現を確認していたが、免疫細胞染色を行ったところ、H2172 (RB1にpathogenic mutationを有している)以外の5細胞株ではRb1陽性であることが確認された。この5細胞株に対して過去に実験系を確立しているリポフェクションによるプラスミド導入でRB1のノックアウトを複数回試みてサブクローニングを行ったが、RB1がノックアウトしたクローンを得ることができなかった。代替の手段としてCas9タンパクとsingle guide RNAの混合物をエレクトロポレーションで肺癌細胞株PC-9に導入することを試みたところ、免疫細胞染色ではおよそ85%の細胞でRb1発現が消失しており、サブクローニングして得られた10クローンのうち9クローンでRb1の発現消失が確認された。それぞれからDNAを抽出して切断領域の塩基配列を確認したところ、いずれもRB1の配列が1-14塩基欠失していることが確認された。in vivoの実験としては申請者の所属する機関の動物実験倫理委員会にプロトコルを提出して実験開始の承認を得た。ヌードマウスに肺癌細胞株PC-9を皮下注して腫瘍の生着を見る実験系の立ち上げを行った。BALB/c -nu/nuではmatrigelと混合して皮下注したマウスに、BALB/c scidでは細胞株単独で皮下注したマウスに皮下腫瘤の形成が見られた。

在候选肺癌细胞系中，HCC2935的生长速度非常缓慢，并且确定在试验中使用它是不现实的。在初步实验中，剩余的六个细胞系通过Western印迹证实了RB1的表达，但是免疫细胞染色证实，除H2172以外的五个细胞系中的RB1阳性（在RB1中具有致病性突变）。尽管这五个细胞系通过使用Lipofection引入质粒多次（以前已经建立以实验地敲除RB1）来亚克隆，但我们无法获得具有RB1敲除的克隆。作为替代方案，我们试图通过电穿孔引入Cas9蛋白和单个引导RNA的混合物，并通过电穿孔将RB1表达在大约85％的细胞中丢失，并且在大约85％的细胞中丢失了RB1表达，并且在10个亚克隆的克隆中，该子序列中的9个通过子插曲获得了RB1的表达，RB1表现出了RB1的表达。从它们中提取DNA，以确认裂解区域的碱基序列，并确认将RB1序列从每个中的1-14个碱基中删除。作为一个体内实验，该方案已提交申请人所属的机构的动物实验伦理委员会，并获得了实验开始的批准。向肺癌细胞系PC-9皮下注射裸鼠，以启动实验系统以查看肿瘤的植入。 BALB/C -NU/NU/NU在与基质醇混合的小鼠中表现出皮下肿块，而BALB/C SCID在皮下注射单独注射细胞系的小鼠中显示皮下肿块。