TKI投与によるEGFR遺伝子変異陽性肺腺癌の小細胞癌への形質転換に関する研究

EGFR基因突变阳性肺腺癌TKI转化为小细胞癌的研究

• 批准号: 22K16186
• 负责人: 前村 啓太
• 金额: $ 2.91万
• 依托单位: The University of Tokyo
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
• 财政年份: 2022
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2022-04-01 至 2024-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-22K16186/
• 关键词: 肺癌; EGFR; 肺小細胞癌; 形質転換

候補となる肺癌細胞株のうちHCC2935については増殖速度が極めて遅く、耐性化の実験に用いるのは現実的ではないと判断した。残りの6細胞株に対して、予備実験ではウエスタンブロットでRb1の発現を確認していたが、免疫細胞染色を行ったところ、H2172 (RB1にpathogenic mutationを有している)以外の5細胞株ではRb1陽性であることが確認された。この5細胞株に対して過去に実験系を確立しているリポフェクションによるプラスミド導入でRB1のノックアウトを複数回試みてサブクローニングを行ったが、RB1がノックアウトしたクローンを得ることができなかった。代替の手段としてCas9タンパクとsingle guide RNAの混合物をエレクトロポレーションで肺癌細胞株PC-9に導入することを試みたところ、免疫細胞染色ではおよそ85%の細胞でRb1発現が消失しており、サブクローニングして得られた10クローンのうち9クローンでRb1の発現消失が確認された。それぞれからDNAを抽出して切断領域の塩基配列を確認したところ、いずれもRB1の配列が1-14塩基欠失していることが確認された。in vivoの実験としては申請者の所属する機関の動物実験倫理委員会にプロトコルを提出して実験開始の承認を得た。ヌードマウスに肺癌細胞株PC-9を皮下注して腫瘍の生着を見る実験系の立ち上げを行った。BALB/c -nu/nuではmatrigelと混合して皮下注したマウスに、BALB/c scidでは細胞株単独で皮下注したマウスに皮下腫瘤の形成が見られた。

The candidate lung cancer cell line HCC2935 is characterized by high growth rate, tolerance and realization. Rb1 positive expression was confirmed in 5 cell lines except for H2172 (RB1 pathogenic mutation) by immunocytochemical staining. The five cell lines were established in the past and introduced into RB1. The RB1 cells were tested in multiple ways. The expression of Rb 1 disappeared in 85% of the cells by immunocytochemical staining. The expression of Rb 1 disappeared in 10 cases. The DNA was extracted and the nucleotide sequence of RB1 was confirmed. In vivo, the animal health ethics committee of the organization to which the applicant belongs shall submit the application for recognition at the beginning. The lung cancer cell line PC-9 was established in 1998. BALB/c nu nu nu