変異型SERPING1の発現抑制による遺伝性血管性浮腫の治療法の開発

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令和4年度は、C末端にFlag-tagを導入した野生型とC末端にHA-tagを導入した変異型（p.S150F）のcDNAの塩基配列をpIRESベクターにクローニングし、培養細胞（HEK293T）にトランスフェクションした後に、細胞溶解液を回収して抗Flag抗体と抗HA抗体を用いたwestern blot（WB）法を実施した。その結果、各C1INHの十分な発現を確認できたが、発現の際に生成される野生型と変異型のmRNAが連続しているため、当初の予定通りの実験には適さないことに気が付いた。そこで、C末端にFlag-tagを導入した野生型と変異型C1INHを個別に発現するベクターを用いて実験を行うことにした。変異が存在する塩基を含むように変異型SERPING1-mRNAに対するsiRNAを計10種類作製し、野生型と変異型のそれぞれをHEK293T細胞に過剰発現させた後に各siRNAをトランスフェクションした。48時間後に細胞溶解液を回収し、抗Flag抗体を用いたWB法を行い、野生型の発現量は低下しないが変異型の発現量は低下するようなsiRNAを探索した。その結果、2種類のsiRNAで、野生型の発現量は変化せず、変異型の発現量のみが顕著に低下することが判明した。これら2種類のsiRNAを、C末端にFlag-tagを導入した野生型とC末端にHA-tagを導入した変異型C1INHを培養細胞に共発現させた条件下でトランスフェクションし、48時間後に細胞溶解液と細胞培養液を回収した後に抗Flag抗体と抗HA抗体を用いたWB法を実施した。その結果、siRNAによって変異型C1INHの発現が抑制されたことで、野生型C1INHの細胞内での発現および分泌量が有意に回復することが示された。