変異型SERPING1の発現抑制による遺伝性血管性浮腫の治療法の開発

通过抑制突变型 SERPING1 的表达开发治疗遗传性血管性水肿的方法

• 批准号: 22K16264
• 负责人: 安野 秀一郎
• 金额: $ 2万
• 依托单位: Yamaguchi University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
• 财政年份: 2022
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2022-04-01 至 2024-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-22K16264/
• 关键词: 遺伝性血管性浮腫Ｉ型; HAE1; SERPING1; C1INH; siRNA; 遺伝性血管性浮腫

令和4年度は、C末端にFlag-tagを導入した野生型とC末端にHA-tagを導入した変異型（p.S150F）のcDNAの塩基配列をpIRESベクターにクローニングし、培養細胞（HEK293T）にトランスフェクションした後に、細胞溶解液を回収して抗Flag抗体と抗HA抗体を用いたwestern blot（WB）法を実施した。その結果、各C1INHの十分な発現を確認できたが、発現の際に生成される野生型と変異型のmRNAが連続しているため、当初の予定通りの実験には適さないことに気が付いた。そこで、C末端にFlag-tagを導入した野生型と変異型C1INHを個別に発現するベクターを用いて実験を行うことにした。変異が存在する塩基を含むように変異型SERPING1-mRNAに対するsiRNAを計10種類作製し、野生型と変異型のそれぞれをHEK293T細胞に過剰発現させた後に各siRNAをトランスフェクションした。48時間後に細胞溶解液を回収し、抗Flag抗体を用いたWB法を行い、野生型の発現量は低下しないが変異型の発現量は低下するようなsiRNAを探索した。その結果、2種類のsiRNAで、野生型の発現量は変化せず、変異型の発現量のみが顕著に低下することが判明した。これら2種類のsiRNAを、C末端にFlag-tagを導入した野生型とC末端にHA-tagを導入した変異型C1INHを培養細胞に共発現させた条件下でトランスフェクションし、48時間後に細胞溶解液と細胞培養液を回収した後に抗Flag抗体と抗HA抗体を用いたWB法を実施した。その結果、siRNAによって変異型C1INHの発現が抑制されたことで、野生型C1INHの細胞内での発現および分泌量が有意に回復することが示された。

In 2004, the wild type (p.S150F), the C-terminal (Flag-tag), the wild-type (p.S150F), the C-terminal (HA-tag), the wild-type (p.S150F), the wild-type, the C-terminal, the C-terminal, the wild-type, the C-terminal, the C-terminal, the wild-type, the C-terminal, the wild-type, the wild-type, the C-terminal, the cDNA, the wild type, the C-terminal, the C-terminal, the cDNA, the wild type, the C-terminal, the C-terminal, the wild type, the C-terminal, the C-terminal, the cDNA, the wild type, the C-terminal The results show that each C1INH is now able to confirm that it is not valid, and that it is possible to generate a link between wild-type and wild-type mRNA, which was scheduled to be paid. The wild type and C-terminal Flag-tag are imported into the wild type and the wild type C1INH respectively. There are 10 types of wild-type SERPING1-mRNA, including wild-type and wild-type siRNA, which are classified into two categories, namely, wild type, wild type and wild type. After 48 hours, the cytolytic solution was returned, the anti-Flag antibody was detected by WB method, and the wild type antibody was detected by Elisa. The results showed that two types of siRNA, the wild type, the wild type, and the type of wild type were significantly different from each other. The wild type siRNA, the C-terminal HA-tag and the wild-type C1INH culture cells were transferred into the wild-type and C-terminal C1INH cells. After 48 hours, the cell lysate and the cell culture solution were returned and the anti-HA antibodies and anti-HA antibodies were tested by WB method. According to the results of the experiment, the results showed that siRNA and wild-type C1INH showed significant inhibition, and that the secretion of wild-type C1INH was significantly higher than that of wild-type.