変異型SERPING1の発現抑制による遺伝性血管性浮腫の治療法の開発

通过抑制突变型 SERPING1 的表达开发治疗遗传性血管性水肿的方法

• 批准号: 22K16264
• 负责人: 安野 秀一郎
• 金额: $ 2万
• 依托单位: Yamaguchi University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
• 财政年份: 2022
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2022-04-01 至 2024-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-22K16264/
• 关键词: 遺伝性血管性浮腫Ｉ型; HAE1; SERPING1; C1INH; siRNA; 遺伝性血管性浮腫

令和4年度は、C末端にFlag-tagを導入した野生型とC末端にHA-tagを導入した変異型（p.S150F）のcDNAの塩基配列をpIRESベクターにクローニングし、培養細胞（HEK293T）にトランスフェクションした後に、細胞溶解液を回収して抗Flag抗体と抗HA抗体を用いたwestern blot（WB）法を実施した。その結果、各C1INHの十分な発現を確認できたが、発現の際に生成される野生型と変異型のmRNAが連続しているため、当初の予定通りの実験には適さないことに気が付いた。そこで、C末端にFlag-tagを導入した野生型と変異型C1INHを個別に発現するベクターを用いて実験を行うことにした。変異が存在する塩基を含むように変異型SERPING1-mRNAに対するsiRNAを計10種類作製し、野生型と変異型のそれぞれをHEK293T細胞に過剰発現させた後に各siRNAをトランスフェクションした。48時間後に細胞溶解液を回収し、抗Flag抗体を用いたWB法を行い、野生型の発現量は低下しないが変異型の発現量は低下するようなsiRNAを探索した。その結果、2種類のsiRNAで、野生型の発現量は変化せず、変異型の発現量のみが顕著に低下することが判明した。これら2種類のsiRNAを、C末端にFlag-tagを導入した野生型とC末端にHA-tagを導入した変異型C1INHを培養細胞に共発現させた条件下でトランスフェクションし、48時間後に細胞溶解液と細胞培養液を回収した後に抗Flag抗体と抗HA抗体を用いたWB法を実施した。その結果、siRNAによって変異型C1INHの発現が抑制されたことで、野生型C1INHの細胞内での発現および分泌量が有意に回復することが示された。

In 2022, the base sequences of the cDNA of the wild type with Flag-tag introduced at the C-terminus and the mutant (p.S150F) in which HA-tag was introduced at the C-terminus were cloned into a pIRES vector, transfected into cultured cells (HEK293T), and the cell lysates were collected and the western blot (WB) method was performed using anti-Flag and anti-HA抗体。结果，我们证实了每个C1INH的表达足够，但是我们意识到表达过程中产生的野生型和突变mRNA是连续的，因此不适合计划的实验。因此，我们决定使用一个向量分别表达野生型和突变体C1INH的矢量，在该v末端引入了标志-TAG。准备突变的Serping1-MRNA的10个siRNA准备包含存在突变的碱，并且在转染每个siRNA之前，在HEK293T细胞中在HEK293T细胞中过表达每个野生型和突变体形式。 48小时后，收集细胞裂解物，并使用抗FLAG抗体进行WB方法，以搜索不会降低野生型表达水平但突变体类型的表达水平的siRNA。结果，发现野生型的表达水平在两个siRNA中没有变化，并且仅突变类型的表达水平显着降低。这两种类型的siRNA是在C-terminus引入的野生型带有标志性标记的条件下转染的，在C-terminus中引入了与在C末端引入的HA-TAG的突变体C1INH在培养的细胞中共表达，48小时后，细胞裂解物和细胞培养基被收集，随后采用抗抗抗抗抗蛋白抗抗体和抗蛋白抗替伯斯抗体。结果表明，突变体C1INH的表达被siRNA抑制，导致细胞中野生型C1INH的表达和分泌显着恢复。