Elucidation of how to prevent the progression of fulminant type 1 diabetes targeting self-reactive T cells

阐明如何针对自身反应性 T 细胞预防暴发性 1 型糖尿病的进展

• 批准号: 22K16401
• 负责人: 北川 暢子
• 金额: $ 2.91万
• 依托单位: Kyoto Prefectural University of Medicine
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
• 财政年份: 2022
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2022-04-01 至 2024-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-22K16401/
• 关键词: 劇症1型糖尿病; 自己反応性T細胞受容体(TCR); シングルセルV (D) Jシークエンス; サイトカインアッセイ

申請者らのグループで実施しているKAMOGAWA-DMコホートから劇症1型糖尿病症例2例、および他の１型糖尿病症例（急性発症１A/1B型、緩徐進行１型）を選出し、ヒト末梢血単核球 (Human PBMC) を採取・保存した。対象患者のHuman PBMCを用いて、BD RhapsodyシングルセルVDJシークエンスを実施した。また、Human PBMCを用いたex vivoの刺激培養実験（サイトカインアッセイ）を実施、フローサイトメトリー（FACS）で各症例の免疫細胞の分画を定量的に評価した。BD Rhapsodyシングルセル解析システムにより単一細胞化し、VDJシークエンス用アプリケーションを用いて分子バーコード化cDNAライブラリーを作成した。作成したcDNAはイルミナ社製次世代シークエンサーによりFASTQを得た。得られたFASTQはBDパイプラインによりクラウドでマッピングの上、リードカウント情報を得てデータマトリックスを作成。TCR配列の多様性解析については、公的データベースを用い、リファレンス配列との相同性解析によるV領域、D領域、J領域遺伝子の同定、アミノ酸配列変換、CDR3配列の抽出、リード数集計を実施し、各群で比較した。さらにTCRごとの遺伝子発現パターンから活性化状態にあるT細胞のTCR配列を同定した。サイトカインアッセイでは、劇症1型糖尿病症例PBMCをヒト膵島自己抗原（GAD65、IA-2、insulin）のオーバーラップペプチドで刺激培養して、IFNγ産生CD8陽性T細胞がex vivoで活性化、IFNγ 産生細胞比率が上昇した。症例ごとにGAD65、IA-2、insulinに対する反応性が異なった。また、劇症1型糖尿病と他の各糖尿病型の比較では、IFNγ産生T細胞比率に明確な差がなかった（第66回日本糖尿病学会年次学術集会で発表予定）。

The applicant was selected from 2 cases of acute type 1 diabetes mellitus and 2 cases of other type 1 diabetes mellitus (acute type 1A/1B and slow type 1), and peripheral blood mononuclear cells (PBMC) were collected and stored. The Human PBMC of the target patient was treated with BD Rhapsody System. Human PBMC were used in ex vivo stimulation and culture to carry out and evaluate quantitative analysis of immune cells in each case. BD Rhapsody Analysis System is a cellular system, VDJ analysis system is a molecular system, cDNA analysis system is a molecular system. The next generation of FASTQ was created. Get FASTQ BD to get information from the top of the list. Diversity analysis of TCR alignment includes identification of V-domain, D-domain and J-domain genes, diversity analysis of TCR alignment, extraction of CDR3 alignment, implementation of diversity set calculation, and comparison of groups. The TCR gene expression and activation of T cells were determined simultaneously. PBMC from patients with type 1 diabetes mellitus were stimulated with their own antigens (GAD65, IA-2, insulin), and IFN γ-producing CD8-positive T cells were activated ex vivo. The percentage of IFNγ-producing cells increased. For example, GAD65, IA-2 and insulin are different in nature. Comparison of IFNγ-producing T cell ratios among different diabetes types (66th Annual Meeting of Japan Diabetes Association)

项目成果

1 型糖尿病での自己膵島抗原反応性 T 細胞の質的異常の解析

1型糖尿病自体胰岛抗原反应性T细胞定性异常分析

• 发表时间: 2023
• 作者: 北川功幸;北川暢子;濵口真英;今井暖;松井崇晃;岡村拓郎;福井道明
• 通讯作者: 福井道明