Elucidation of how to prevent the progression of fulminant type 1 diabetes targeting self-reactive T cells

点击翻译按钮获取中文摘要

申請者らのグループで実施しているKAMOGAWA-DMコホートから劇症1型糖尿病症例2例、および他の１型糖尿病症例（急性発症１A/1B型、緩徐進行１型）を選出し、ヒト末梢血単核球 (Human PBMC) を採取・保存した。対象患者のHuman PBMCを用いて、BD RhapsodyシングルセルVDJシークエンスを実施した。また、Human PBMCを用いたex vivoの刺激培養実験（サイトカインアッセイ）を実施、フローサイトメトリー（FACS）で各症例の免疫細胞の分画を定量的に評価した。BD Rhapsodyシングルセル解析システムにより単一細胞化し、VDJシークエンス用アプリケーションを用いて分子バーコード化cDNAライブラリーを作成した。作成したcDNAはイルミナ社製次世代シークエンサーによりFASTQを得た。得られたFASTQはBDパイプラインによりクラウドでマッピングの上、リードカウント情報を得てデータマトリックスを作成。TCR配列の多様性解析については、公的データベースを用い、リファレンス配列との相同性解析によるV領域、D領域、J領域遺伝子の同定、アミノ酸配列変換、CDR3配列の抽出、リード数集計を実施し、各群で比較した。さらにTCRごとの遺伝子発現パターンから活性化状態にあるT細胞のTCR配列を同定した。サイトカインアッセイでは、劇症1型糖尿病症例PBMCをヒト膵島自己抗原（GAD65、IA-2、insulin）のオーバーラップペプチドで刺激培養して、IFNγ産生CD8陽性T細胞がex vivoで活性化、IFNγ 産生細胞比率が上昇した。症例ごとにGAD65、IA-2、insulinに対する反応性が異なった。また、劇症1型糖尿病と他の各糖尿病型の比較では、IFNγ産生T細胞比率に明確な差がなかった（第66回日本糖尿病学会年次学術集会で発表予定）。