Development of synovial sarcoma patient model for new drug therapy

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本研究では滑膜肉腫特異的な融合遺伝子であるSS18-SSX1融合遺伝子の遺伝子操作を予定している。遺伝子操作にはCRISPR CAS9システムを用いた融合遺伝子の内在性の誘導法と、従来のウイルスベクターによる人工融合遺伝子の導入法を用いて、両郡の細胞からの発現解析を行う。本研究において、遺伝子修飾技術が問題なく使用できるか事前検証する必要があった。そこで、同様に融合遺伝子の誘導法が議論されている粘液型脂肪肉腫のFUS-DDIT3を対象として上記実験を開始した。まずは従来の方法であるウイルスベクターを用いた融合遺伝子の強制導入・発現実験は首尾よく成果が得られている。レンチウイルスに２種類の制限酵素を用いて人工融合遺伝子をクローニングし、大腸菌内で増幅させプラスミドベクターを精製した。 パッケージング細胞にコトランスフェクションさせ、形成されるウイルスコアは細胞膜に輸送され、感染性のウイルス粒子として細胞膜から出芽し培地中に放出される。これを、マウス線維芽細胞(3T3L1)細胞に感染導入を試みた。さらに、このベクターはネオマイシン耐性遺伝子を発現するため、同抗生剤下に細胞を培養し細胞選択を行った。得られた細胞株よりDNA、cDNR(RNA)、タンパク質と順に発現を確認した。現在は、同細胞株と正常細胞(3T3L1)をヌードマウスに皮下投与し腫瘍形成能の評価を行っている。一方、CRISPR/CAS9システムを用いた方法では、最適なガイドRNAをFusのイントロン7とDdit3のイントロン1を標的として設計し、 ガイドRNAとCas9 Nickaseを同時に発現させるベクターにそれぞれの標的配列をアニーリングし、ベクターを構築した。 トランスフェクションはLipofectamine を用いた。現在までに数回に渡り標的融合遺伝子の転座誘導をDNAで確認した。