体外培養卵子誘導系/ChIL-seqを用いたヒト原始卵胞のFOXO1Aの機能解析

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本研究では「ヒトの原始卵胞形成および維持におけるhFOXO1Aの機能を明らかにすること」を目的とし、マウス体外培養系を用いて表現型を、ChIL-seqによって分子標的をそれぞれ解明する。マウス原始卵胞では機能因子であるmFOXO3aが核内に局在し、活性化卵胞では核外に移行する。まず、hFOXO1AがmFOXO3aと同様の発現パターンを示すことをヒト卵巣組織切片で確認した。ChIL-seqでは未固定の凍結切片を用いるために手術で摘出したヒト卵巣組織の凍結切片において、hFOXO1Aの免疫染色の条件検討を行った。ヒト卵巣組織凍結切片の免疫組織化学染色および免疫蛍光染色で原始卵胞と活性化卵胞におけるhFOXO1Aの細胞内局在を確認し、また卵巣における原始卵胞の分布を確認した。卵巣組織内の原始卵胞を多く含む領域を含む断面で凍結切片を作製することでCｈIL-seqにより適した凍結切片を得ることが出来た。以前にNobox、Figla、Tbpl2、Lhx8 の4 つの転写因子(PPT4：primordial-to-primary-follicle transition)を強制発現させたES細胞から短時間で体外培養卵子誘導系を報告した。この系を用いて解析を行うために、PPT4を遺伝子導入したmFOXO3a KO mES細胞を樹立した。このmES細胞に導入するmFOXO3a⊿NES、hFOXO1A、hFOXO1A⊿NESのベクターを作製し、293T細胞にトランスフェクション後に免疫蛍光染色し、計画通りにmFOXO3aおよびhFOXO1Aの核内・核外発現をコントロール出来ていることを確認した。