病的新生血管の制御を目指した新規網膜器官培養法の開発

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本研究では、マウス網膜の器官培養法を新たに開発し、発生期もしくは病的血管新生でみられる細胞動態を評価するため観察系の構築を目指す。本年度は、器官培養法の開発を試みた。予備研究で課題であった網膜の変形は、type1コラーゲンに網膜を埋め込むことで形状保持を可能とした。網膜血管の発生を再現できる網膜器官培養に適した培地ならびにサプリメントを検討した。生後4日の新生仔マウス網膜を種々の培地・サプリメントを用いて40%酸素濃度下に24時間培養した後、ホールマウント免疫染色により培養網膜の血管形態ならびに内皮数を生後5日マウス網膜のそれと比較した。神経系細胞に適したB27・N2サプリメントを添加した培地では血管伸長、血管径、血管分岐数のいずれも減少し、内皮細胞は数だけでなく配向にも凝集様の変化がみられた。一方、血管内皮細胞に適したVEGFとFGFを添加した培地では、血管伸長、血管径、分岐数は神経系の培地よりも有意に増加したが生後5日マウスと同等にはならなかった。このとき、抗a-SMA、抗NG2抗体による免疫染色においてペリサイトによる内皮細胞の被覆が障害されていたことから、さらにPDGF-BBを添加して培養したところ、生後5日マウス網膜の血管形態と同等となった。VEGF, FGF, PDGF-BBの３つのサイトカインと化合物を添加した培地を用いることで生体に類似した発生期の血管新生をex vivoで誘導することができた。