歯髄幹細胞を基材とした人工神経様組織のin vitro創製

基于牙髓干细胞的体外人工神经样组织构建

• 批准号: 22K17075
• 负责人: 堅田 千裕
• 金额: $ 2.91万
• 依托单位: Osaka University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
• 财政年份: 2022
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2022-04-01 至 2024-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-22K17075/
• 关键词: 再生歯学; 組織工学; 細胞集合体; オルガノイド

令和4年度は、神経細胞への分化能を有する歯髄幹細胞を用いて細胞集合体を作製し、神経細胞分化誘導培地による長期培養を試みた。長さ12 mm、深さ3 mmのグルーブを付与した温度応答性高分子pNIPAAmゲルにヒト第三大臼歯由来の歯髄幹細胞を播種し、2日間培養することで細胞集合体を作製した。そして、この細胞集合体をB-27などを添加した分化誘導培地を用いて最長20日間の培養を行った。まず、細胞集合体の培養による形態変化を評価したところ、培養5日間で長軸方向の長さが約75%に減少することが分かった。その後、細胞集合体の大きさは経時的に減少し、培養20日目で長さは約50%となったが、細胞集合体の形状は維持していた。このことから、歯髄幹細胞からなる細胞集合体は神経細胞分化誘導培地を用いて長期培養が可能であることが示された。次に、分化培地で最長20日間培養した細胞集合体について、パラフィン包埋薄切切片を作製し、ヘマトキシリン・エオジン染色を行った。その結果、培養5日目の集合体は疎な構造をしているが、培養期間が増加するにつれて内部構造は徐々に密となり、培養20日目では均一な内部構造を呈することが明らかとなった。さらに、細胞集合体を構成する細胞の活性を検討することを目的として、細胞集合体のスライス試料に対してLive/Dead染色を行った。その結果、培養期間が延長するとともに死細胞の数が増加するものの、細胞集合体を構成する大部分の細胞が生存していることが分かった。これらの結果から、歯髄幹細胞からなる細胞集合体は、本研究で用いた分化誘導培地で細胞の活性を維持したままの状態で長期培養が可能であることが明らかとなった。

在2022年，使用具有分化为神经元的牙髓干细胞产生细胞组装，并尝试使用神经元分化诱导培养基尝试长期培养。将源自人类第三磨牙的牙髓干细胞在温度响应的聚合物PNIPAAM凝胶上播种，深度为12毫米，深3毫米，并深3毫米，并培养2天以产生细胞组件。然后使用补充B-27之类的分化感应培养基培养该细胞组件长达20天。首先，当评估由于细胞组件培养而引起的形态变化时，发现在五天的培养过程中，纵向长度降低至约75％。细胞组件的尺寸随时间减小，在培养的20天，长度约为50％，但保持细胞组件的形状。这表明，可以使用神经元分化诱导培养基来实现由牙髓干细胞组成的长期培养。接下来，制备石蜡包裹的薄切片，用于在分化培养基中培养的细胞组装长达20天，并用苏木精蛋白染色。结果，据表明，尽管在培养的第五天的组装中，随着培养期的增加，内部结构逐渐变得密集，并且内部结构在培养的第20天表现出统一的内部结构。此外，为了检查构成细胞组件的细胞活性，细胞组件的切片样品受到活/死染色。结果，发现构成细胞组件的大多数细胞都活着，尽管培养期的增加以及死细胞的数量增加。这些结果表明，可以长期培养由牙髓干细胞组成的细胞组件，同时在本研究中使用的分化诱导培养基中维持细胞活性。

项目成果

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