DNA損傷応答時に相同組換え修復が担うゲノム安定化機構の解明

阐明DNA损伤反应过程中同源重组修复发挥的基因组稳定机制

• 批准号: 22K18036
• 负责人: 藤田 侑里香
• 金额: $ 3万
• 依托单位: Osaka University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
• 财政年份: 2022
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2022-04-01 至 2025-03-31
• 项目状态: 未结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-22K18036/
• 关键词: 相同組換え; DNA損傷; 染色体; がん

本年度はHR関連因子、特に正と負に制御する因子のそれぞれの機能や関係性を明らかにすることを主眼において、作製済みの変異体細胞の解析を中心に行った。また、変異体解析が困難な遺伝子については、siRNA処理により遺伝子を欠損させた後の細胞の、RAD51の局在やDNA損傷の蓄積状況など、表現型解析を行なった。今後タンパク間の相互作用などを検証していく予定である。合わせて、HR因子が機能するDNA複製期（S期）に特に焦点を当て、S期の染色像からS期を前期・中期・後期に分類し、各HR因子の変異体・欠損細胞でRAD51等、HRやDNA複製に関与する因子についてを免疫染色で検証した結果、因子によって主に機能するphaseが異なる可能性が確認された。ただし本年度の検討では各分類における細胞の絶対数に偏りがあることやDNA損傷有無における差異まで比較することができなかったため、来年度以降は細胞の同調やFACSソーティング等を活用して再現性を確認する。さらに、HR関連因子が機能する染色体上の特異性をゲノムワイドに検証するため、RAD51のChIP-seqの条件検討を実施した。RAD51は染色体上における局在が一時的であること等から初回のChIP-seqでは十分なピーク検出は困難であったが、細胞数やリード数などの条件等を行なった結果、DNA損傷下においてRAD51のピークを検出することができ、未処理群と比較してRAD51の結合量及び局在場所に顕著な差異が確認された。この結果を受けて、再現性の確認及び種類の異なる薬剤処理を実施後にChIP-seqを追加実施済みで、現在解析を行っている。

This year, we focused on clarifying the functions and relationships of HR-related factors and specific positive and negative control factors, as well as the analysis of the various cells that control HR. The analysis of DNA damage in RAD51 cells after siRNA treatment is difficult, and phenotype analysis is performed. From now on, the interaction between the two groups will be verified. In addition, HR factors function in DNA replication phase (S phase), special focus, S phase staining, early, middle and late S phase classification, variant and deficient cells of HR factors, RAD51, etc., HR factors related to DNA replication, immunostaining results, factor main function phase differences were confirmed. This year's study was conducted on the number of isolated cells and the presence or absence of DNA damage. In addition, HR-related factors function on chromosome specificity, and RAD51 ChIP-seq conditional analysis is performed. RAD51 was found to be more difficult to detect under conditions such as the number of cells, the number of cells, and the number of cells. The results showed that RAD51 was found to be more difficult to detect under conditions such as DNA damage, and the binding amount of RAD51 was more difficult to detect under conditions such as untreated groups. The results of this study were evaluated, reproducibility confirmed, and different kinds of chemicals were processed. ChIP-seq was added and analyzed.