新しい神経終末膜標本fusasomeを用いたシナプス前受容体の電気生理学的検討

使用新型神经末梢膜制备梭体进行突触前受体的电生理学研究

• 批准号: 09780724
• 负责人: 望月 貴年
• 金额: $ 1.47万
• 依托单位: Osaka Bioscience Institute (1998)Ehime University (1997)
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1997
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1997 至 1998
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-09780724/
• 关键词: synaptosome; fusasome; グルタミン酸; グルタミン酸脱水素酵素; ヒスタミン; H3-受容体

本研究は,神経終末部に存在するヒスタミンH_3-受容体の同定および機能解析を,バッチクランプ法を用いて検討する際に必要な,新しい膜標品の開発を目的とした。すなわち,これまで神経化学研究で用いられてきたsynaptosomeをもとに膜融合させた標品,fusasomeをラット大脳皮質より調製し,これを用いてヒスタミンH_3-受容体の存在を薬理学的,電気生理学的に検討した。まず,前年度から引き続き,synaptosomeからのグルタミン酸遊離に対するH_3-受容体アゴニストの影響を試みた。Percoll密度勾配遠心分離法で調製したsynaptosomeを蛍光光度計内のキュベットに移し,グルタミン酸脱水素酵素とβ-NADP^+を加え,外液中に生じるNADPH量を342nm励起による456nmの蛍光強度で測定した。しかし,H_3-受容体アゴニストであるα-メチルヒスタミンやイメピップの添加は脱分極刺激によるsynaptosomeからのグルタミン酸遊離に影響をおよぼさなかった。次に,GABA代謝酵素を用いて同手法によるsynaptosomeからのGABA遊離を測定し,H_3-受容体アゴニスト添加の影響を検討したが,やはり顕著な変化は見られなかった。しかし,TritonX-100を添加して膜標品を可溶化すると,グルタミン酸,GABA含量を示す反応は十分見られたため,用いた膜標品の脱分極刺激に対する反応性や受容体活性に問題があることが示唆された。次に,synaptosome浮遊液にポリエチレングリコール溶液を加え,4℃で12時間振盪した後,これを透析し,PLLコーティングしたディッシュ底に付着させた。直径約20μmの膜融合物,fusasomeを顕微鏡下,ホールセルクランプ法に準じて膜電流の測定を試みた。しかし,膜とパッチピペット間のギガシール形成が非常に困難であり,安定した膜電流が測定できた例は極めて少なかった。また,-60mVより10mvずつ保持電位を脱分極させ,電位依存性チャネル類の活性を調べたが,Na^+性内向き電流,K^+性外向き電流とも速やかに減少することから,膜融合物のバイアビリティが非常に低いことが分かった。以上のように,神経終末部のみを対象としたH_3-受容体刺激による膜電流の検出は不可能であった。今後はfusasome調製法自体の問題点を明らかにし,より安定した膜標品の開発に努力する。

は, god 経 terminal department に exist す る ヒ ス タ ミ ン H_3 - the capacity of body の be お よ び function analytical を, バ ッ チ ク ラ ン を プ method with い て beg す 検 る interstate に necessary な, new し い membrane standard product の open 発 を purpose と し た. す な わ ち, こ れ ま で 経 chemical research で with god い ら れ て き た synaptosome を も と に membrane fusion さ せ た non-standard products, fusasome を ラ ッ ト big 脳 cortex よ り modulation し, こ れ を with い て ヒ ス タ ミ ン H_3 exist - the capacity of body の を 薬 neo-confucianism, electric 気 physiology に beg し 検 た. ま ず, former annual か ら lead き 続 き, synaptosome か ら の グ ル タ ミ ン acid free に す seaborne る H_3 - the capacity of body ア ゴ ニ ス ト の influence を try み た. Percoll density hook with telecentric separation で modulation し た synaptosome を 蛍 light photometer の キ ュ ベ ッ ト に し, グ ル タ ミ ン acid dehydration vegetable enzyme と beta NADP ^ + を え, outside liquid に in じ る NADPH quantity を 342 nm wound up に よ る 456 nm の 蛍 light intensity で determination し た. し か し H_3 - let body ア ゴ ニ ス ト で あ る alpha メ チ ル ヒ ス タ ミ ン や イ メ ピ ッ プ の add は points off very stimulating に よ る synaptosome か ら の グ ル タ ミ ン acid free に influence を お よ ぼ さ な か っ た. を に, GABA metabolism enzyme with い て with technique に よ る synaptosome か ら の GABA free を し, H_3 - let body ア ゴ ニ ス ト add の influence を beg し 検 た が, や は り 顕 the な variations change は see ら れ な か っ た. し か し, TritonX - 100 を add し て membrane standard product を solubilization す る と, グ ル タ ミ ン acid, GABA を す indicated the 応 は very see ら れ た た め, use い た membrane standard product の points off very stimulate に す seaborne る anti 応 sex や problem let body active に が あ る こ と が in stopping さ れ た. Time に synaptosome floating liquid に ポ リ エ チ レ ン グ リ コ ー ル solution を え, 4 ℃ で 12 time oscillation し た after こ れ を dialysis し, PLL コ ー テ ィ ン グ し た デ ィ ッ シ ュ bottom に pay the さ せ た. About 20 microns in diameter の membrane fusion, fusasome を 顕 micro microscopically, ホ ー ル セ ル ク ラ ン プ method に quasi じ て membrane current の determination を try み た. し か し, membrane と パ ッ チ ピ ペ ッ ト between の ギ ガ シ ー ル form が very difficult に で あ り, settle し た membrane current が determination で き た example は extremely め て less な か っ た. ま た, 60 mv よ り 10 mv ず つ keep potential を points off very さ せ, potential dependency チ ャ ネ ル class の activity を adjustment べ た が, Na ^ + き within current, current K ^ + sexually extroverted き と も speed や か に reduce す る こ と か ら, membrane fusion の バ イ ア ビ リ テ ィ が very low に い こ と が points か っ た. The above <s:1> ように, the final part of the Shinto economy <s:1> みを is impossible for the と <s:1> たH_3- the による membrane current <e:1> 検 to be 検 when stimulated by the capacitance であった であった. In the future, the <s:1> fusasome modulation method self-problem points を, ら に に する,よ, <s:1>, <s:1>, and た film standard products <s:1> should make に efforts する.

项目成果

Guo Y.: "Role of mast cell histamine in the formation of rat paw edema;a microdilysis study." Eur.J.Pharmacol.331. 237-243 (1997)

郭Y.：“肥大细胞组胺在大鼠爪水肿形成中的作用；一项微透析研究。”

Huang Z.L.: "Biphasic elevation of plasma histamine induced by water immersion stress, and their sources in rats." Eur.J.Phamacol.360・2-3. 139-146 (1998)

Huang Z.L.：“水浸应激引起的血浆组胺双相升高及其在大鼠中的来源。”Eur.J.Phamacol.360·2-3（1998）。

Jansen F.P.: "In vivo modulation of rat hypothalamic histamine release by the histamineH_3 receptor ligands, immepip and clobenpropit. Effects of intrahypothalamic and peripheral application." Eur.J.Pharmacol.362・2-3. 149-155 (1998)

Jansen F.P.：“组胺H_3受体配体immepip和clobenpropit对大鼠丘脑组胺释放的体内调节。下丘脑内和外周应用的影响。”Eur.J.Pharmacol.362·2-3（1998）。

望月貴年: "マイクロダイアリシス法の末梢組織への応用-脳、血中、皮下組織内ヒスタミン遊離の測定-" 愛媛医学. 17・2. 103-107 (1998)

望月隆：“微透析法在外周组织中的应用-脑、血液和皮下组织中组胺释放的测量-”爱媛医学17・2（1998）。

望月 貴年: "生態アミンと睡眠-覚醒サイクル" 日本臨牀. 56・2. 20-25 (1998)

望月隆：“生态胺与睡眠-觉醒周期”Nippon Rinbaku 56・2（1998）。