ジベレリン生産糸状菌由来のカウレン合成酵素の構造と環化反応機構に関する研究

产赤霉素丝状真菌贝壳杉烯合酶的结构及环化反应机制研究

• 批准号: 10760074
• 负责人: 川出 洋
• 金额: $ 1.15万
• 依托单位: The Institute of Physical and Chemical Research
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1998
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1998 至 1999
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-10760074/
• 关键词: biosynthesis; diterpene cyclase; ent-kaurene synthase; gibberellin; site-directed mutagenesis; 生合成; cyclase; ジテルペン; fungus; Phaeosphaeria sp.; site-directed muta genesis

(1)放射性標識コパリ二リン酸(CDP)の調製と精製を行った.市販されているトリチウム標識ゲラニルゲラニル二リン酸(GGDP)と大腸菌で作製した組換えCDP合成酵素(CPS)との反応からトリチウム標識CDPを合成した.粗抽出されたものを逆相系のイオンペアクロマトグラフィーにより精製し,基質として用いた.(2)Phaeosphaeria sp.L487株由来のカウレン合成酵素(FCPS/KS)の酵素反応を速度論的に解析し,これらを植物由来のCPSおよびカウレン合成酵素(KS)と比較した.FCPS/KSでは,CDPの親和性がGGDPよりも高く,KS活性の方がCPS活性よりも高かった.これは植物モデルとして用いたカボチャ由来のCPSおよびKSと似た傾向であった.しかしながら,植物のCPSでは高濃度のGGDPに対して基質阻害を示すのに対し,FCPS/KSではそのような阻害傾向は認められなかった.この違いは,植物におけるホルモン生合成とカビにおける二次代謝産物の生合成の制御機構の一つかもしれないと考えられた.(3)前年度に作製したFCPS/KSの各種組換え変異タンパク質(部位特異的変異体およびデリーション変異体)を精製し,それらの酵素活性を精密に調べた.FCPS/KSのアミノ末端側はCPS反応に関与し,カルボキシ末端側はKS反応に関与するが,精製タンパク質を用いて精査した結果,アミノ末端側はCPS反応だけでなくKS反応にも重要な影響を有するドメインであることが判明した.反応メカニズムが異なる植物のCPSおよびKS,あるいは他のジテルペン環化酵素でも,FCPS/KSのアミノ末端側と保存性の高い領域がある.多くのジテルペン環化酵素にみられるこの領域は,反応中の酵素を安定化させたり酵素-基質複合体になったときの安定化に重要な役割を持っているのかもしれない.(4)山形大学のグループによってcDNAクローニングされたGibberella fujikuroi由来のカウレン合成酵素cDNA(GfCPS/KS)を大腸菌体内で発現させ,組換え融合タンパク質を生産させた.このものの酵素活性は,Phaeosphaeria sp.L487株由来のFCPS/KSと同様,GGDPをCDPを経てカウレンに変換する多機能ジテルペン環化酵素であることを示した.

(1)The modulation and purification of CDP. The market for CDP synthesis is characterized by the production of CDP synthase (CPS) by Escherichia coli and the production of CDP synthase by GGDP. The coarse extract and the reverse phase system are used for refining the matrix. (2) A rate-theoretic analysis of the enzyme reaction of Phaeosphaeria sp.L487 strain was performed to compare its CDP affinity and CPS activity. The origin of this phenomenon is CPS and KS. The CPS of plants shows a high GGDP concentration and resistance to substrate damage, while FCPS/KS shows a resistance tendency to substrate damage. In this way, the plant can produce and control the production and synthesis of secondary metabolites. (3)FCPS/KS in previous years (site-specific variant and variant) refining, fine tuning of enzyme activity.FCPS/KS terminal side CPS reaction, fine tuning of KS terminal side KS reaction, refining of enzyme activity. The end of the line is opposite to the end of the line. Plant CPS and KS,FCPS/KS The enzyme in the enzyme matrix complex stabilizes the enzyme in the enzyme matrix complex. The enzyme in the enzyme matrix stabilizes the enzyme in the enzyme matrix complex. (4)Yamagata University's Genome cDNA Library is a fusion protein library. Gibberella fujikuroi is a fusion protein library derived from Genome cDNA(GfCPS/KS). The enzyme activity of Phaeosphaeria sp.L487 strain is similar to that of FCPS/KS,GGDP, CDP and other multifunctional enzymes.

项目成果

川出 洋: "ジベレリン生産糸状菌由来のent-カウレン合成酵素遺伝子のクローニング" 植物の化学調節. 33・2. 182-192 (1998)

Hiroshi Kawade：“从产生赤霉素的丝状真菌中克隆对映贝壳杉烯合酶基因”《植物化学调控》33・2（1998）。

H.Kawaide,T.Sassa,Y.Kamiya: "Functional analysis of the two interacting cyclase domains in ent-kaurene synthase from the fungus Phaeosphaeria sp.L487 and a comparison with cyclases from higher plants"The Journal of Biological Chemistry. 275. 2276-2280 (20

H.Kawaide、T.Sassa、Y.Kamiya：“来自真菌 Phaeosphaeria sp.L487 的对映贝壳杉烯合酶中两个相互作用的环化酶结构域的功能分析以及与来自高等植物的环化酶的比较”《生物化学杂志》。