糸状菌におけるジベレリン生合成酵素遺伝子クラスターの化学的解析

丝状真菌赤霉素生物合成酶基因簇的化学分析

• 批准号: 13760089
• 负责人: 川出 洋
• 金额: $ 1.34万
• 依托单位: Tokyo University of Agriculture and Technology
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• 财政年份: 2001
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2001 至 2002
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-13760089/
• 关键词: biosynthesis; cytochrome P450; GC-MS; gibberellin; monooxygenase; Pichia pastoris; recombinant protein; 環化酵素; ゲノム; ジベレリン; 植物ホルモン; 生合成; テルペノイド; モノオキシゲナーゼ; Phaeosphaeria sp. L487

Phaeosphaeria sp. L487株由来のジベレリン生合成酵素遺伝子クラスターから,生合成後期ステップに関与する20-oxidase (Ph20ox)をコードすると考えられる遺伝子の機能解析を進めた.ゲノムDNA上の配列からプライマーを設計し,RT-PCR,5'-RACE,3'-RACE等から完全長cDNA配列を決定した.完全長cDNA1761bpのうちタンパク質翻訳領域は1584bpで,膜結合型cytochrome P450モノオキシゲナーゼとして528アミノ酸残基をコードしていた.Ph20oxのアミノ酸配列は,イネ馬鹿苗病菌Gibberella fujikuroi由来の20-oxidaseと52%程度の相同性があった.異種タンパク質の形でPh20oxの酵素機能を調べるため,Ph20oxをメタノール資化性酵母用のベクター(pPICZ-B)に組み込み,メタノール資化性の高いPichia pastoris SMD1168株と資化性の低いP. pastoris KM71株を形質転換した.得られた形質転換体それぞれ1菌株ずつを用いて組変えタンパク質生産誘導とともにジベレリン基質・GA_<12>を添加して6日間培養を続けたところ,GA_<12>の代謝物としてGA_9 and/or GA_<25>をGC-MS分析により同定した.以上の結果より,カビ由来の20-oxidaseの酵素遺伝子の機能について異種タンパク質発現系を用いて初めて証明できた.現在,詳細な酵素反応解析ができるように,セルフリー系での実験の可能性を検討している.さらに,ジベレリン20-oxidaseがカビと植物とは全く異なる酵素種で関与していることに注日して,植物体内でカビ由来の膜結合型モノオキシゲナーゼタイプの20-oxidaseが成長制御に関与できるかどうかを調べるために,植物発現用コンストラクトを調製した.

Phaeosphaeria sp. L487 strain originates from のジベレリン生anasynthetic enzyme 缝子クラスターから, biosynthetic late stage ステップにSeki and する20-oxidase (Ph20ox)をコードすると考えられる伝子の Functional Analysisを入めた.ゲノArrangement design on DNA,RT-PCR,5'-RACE,3 '-RACE et al. Complete length cDNA alignment decision. Complete length cDNA 1761bp のうちタンパク qualitative translation field は1584bp で, membrane-bound cytochrome P450 モノオキシゲナーゼとして528 アミノ acid residue をコードしていた. Ph20ox のアミノ acid compound は, イネ red deer seedling pathogen Gibberella fujikuroi origin の20-oxidase と 52% degree の sameness が あ っ た. Different species タ ン パ ク quality の shape で Ph20ox の enzyme function を adjustment Pichia pastoris SMD1168 strain is P. pastoris with low adaptability The KM71 strain was transformed into a morphological substance. The られた morphological substance was changed into a それぞれ1 strain and the いて group was used to induce とともにジベレリン matrix・GA_<12>をadded して6 day culture を続けたところ, GA_<12>のmetabolite としてGA_9 and/or GA_<25> GC-MS analysis of the same により同定した. The above results are より, カビorigin of 20-oxidase のenzyme legacy の function of について heterogeneous タンThe nature of the パク発 present system is proved by いて初めてできた. Now, detailed enzyme reaction analysisができるように,セルフリーsystem での実験のpossibilityを検している.さらに, ジベレリン20-oxidase がカビとplant とは全くisoなるenzyme species で Off and していることに NOTE 日して, でカビorigin in the plant のmembrane-bound typeノオキシゲナーゼタイプの20-oxidaseがgrowth controlに关与でThe plant is now made of コンストラクトを.

项目成果

出川 洋, 豊増知伸, 神谷勇治, 佐々武史: "糸状菌由来のジベレリン生合成酵素遺伝子と機能"日本農芸化学会誌. 76巻・12号. 1195-1198 (2002)

Hiroshi Dekawa、Tomonobu Toyomasu、Yuji Kamiya、Takeshi Sasa：“源自丝状真菌的赤霉素生物合成酶基因和功能”日本农业化学学会杂志第 76 卷，第 1195-1198 期（2002 年）。