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GFP-Rb融合蛋白質の生細胞における核内局在の検討

活细胞中 GFP-Rb 融合蛋白核定位的检查

基本信息

批准号：
12780534
负责人：
武村政春
金额：
$ 1.34万
依托单位：
Nagoya University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
2000
资助国家：
日本
起止时间：
2000 至 2001
项目状态：
已结题

项目摘要

これまで癌抑制遺伝子産物Rb蛋白質の研究は、低リン酸化型の細胞増殖抑制能にのみ焦点が当てられて来たが、私はこの数年、高リン酸化型の細胞増殖への積極的機能分担の可能性を指摘して来た。昨年度は、GFP融合法を用いたRb蛋白質の細胞内局在の検討により、S期後期に高リン酸化型Rb蛋白質が核小体へ移行すること、その核小体移行にヌクレオフォスミン/B23(以下B23)が関与していることを報告した。本年度はその結果を受け、高リン酸化型Rb蛋白質の核小体移行メカニズムの更なる検討と、核小体移行の生物学的意義の解明を目指して研究を行った。まず、昨年度の研究において示唆された高リン酸化型Rb蛋白質とB23との相互作用について確認するため、アンチセンス法を用いてB23の蛋白質生成を阻害したところ、Rb蛋白質の核小体移行が抑えられた。また、HeLa細胞から核小体を単離し、その抽出液から抗B23抗体で免疫沈降を行ったところ、高リン酸化型Rb蛋白質が特異的に沈降することがわかった。これらのことは、高リン酸化型Rb蛋白質の核小体移行が、B23によって移行されることを強く示唆している。次に、高リン酸化型Rb蛋白質の核小体移行の生物学的意義について検討を行った。S期後期に核小体へ移行し、何かの役割を持つとすれば、最初に考えられるのはその先にある細胞分裂に先立つ核小体分裂nucleolar segregationにおける役割であろう。単離した核小体に、精製したB23と高リン酸化型Rb蛋白質を加えてインキュベートすると、核小体分裂が起こることを見出した。これはin vitroにおける両蛋白質の過剰存在下での実験であるが、高リン酸化型Rb蛋白質の核小体分裂への関与を示唆するものであり、極めて興味深い知見である。今後、更なる実験により検証していく価値があると考えている。

The study of Rb protein, a cancer suppressor gene product, focused on the inhibition of cell proliferation by low-and high-level acidified forms of Rb protein, and pointed out the possibility of active function sharing in cell proliferation in the past few years. In the past year, GFP fusion method was used to study the intracellular structure of Rb protein, and the nuclear body migration of Rb protein in late S phase was reported. This year, the results of this study were received, and the study of nucleosome migration of highly acidified Rb protein was carried out. In recent years, research has shown that the interaction between highly acidified Rb protein and B23 has been confirmed by the use of the anti-B23 method to inhibit the nucleosome migration of Rb protein. HeLa cells were isolated from nucleosomes, and extracts were isolated from anti-B23 antibodies. The nucleosomal migration of Rb protein, B23 protein and B23 protein are strongly expressed. Biological significance of nucleosomal migration of secondary and highly acidified Rb proteins During the late S phase, nucleosomal migration, nuclear segregation, nuclear segregation, nuclear segregation. The nucleosomes were purified and the nucleosomes were separated. The relationship between nucleosomal fission and high activity of Rb protein in vitro is very interesting. In the future, we will continue to examine and evaluate the results of the study.