ノンターゲット定量プロテオミクスにおける試料調製法の開発

非靶向定量蛋白质组学样品制备方法的开发

• 批准号: 18H00302
• 负责人: 瀧 健太朗
• 金额: $ 0.34万
• 依托单位: Nagoya University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Scientists
• 财政年份: 2018
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2018 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-18H00302/
• 关键词: ノンターゲット定量プロテオミクス; In-solution digestion; 質量分析

液体クロマトグラフ質量分析計(LC-MS)を用いたプロテオーム解析では、タンパク質の網羅的な同定と共に包括的なダイナミスを把握することが求められており、分析前の試料調製についてもその目的に即した処理方法が必要となる。本研究ではプロテオミクスの主要な前処理方法の1つであるIn-solution digestionのワークフローを見直し、特に分析結果への影響が大きいと考えられるタンパク質の変性と精製の方法について検証した。ヒト血清に外因性タンパク質を濃度段階的に添加した試料を用いて、次の4種類の変性、精製処理を行った。①グアニジン塩酸塩(GuCl)を添加、メタノール・クロロホルム沈殿。②GuClを添加、アセトン沈殿。③試料を加熱、精製は行わない。④GuClを添加、精製の代わりに試料を希釈。続いて還元・アルキル化、トリプシン消化を行い、これらの試料をLC-MSで分析し、同定されたペプチド数とタンパク質数から前処理方法の効率を、添加タンパク質由来のペプチドピークエリア値から定量性を評価した。その結果、変性処理ではGuCl添加と試料の加熱とで同定数に顕著な差は見られなかったが、後者はタンパク質の種類によって定量結果が大きく低下した。精製処理ではタンパク質沈殿法(特にメタノール・クロロホルム沈殿)は誤差やロスが生じたのに対し、試料を希釈する方法では最も良好な定量結果が得られた。この方法は迅速かつ簡便であり、さらに調製中のケラチン等のコンタミを最小限に抑えることが可能であった。以上の結果から生体試料を用いた定量プロテオミクスの前処理では、高濃度の変性剤を用いてタンパク質を変性し、続いて試料を希釈してその後に添加するプロテアーゼの活性が維持できるよう変性剤濃度を下げる方法が適していることが明らかとなった。本法は臨床スクリーニングやバイオマーカー探索等の分野でも活用することが可能である。

Liquid Mass Analyzer (LC-MS) is used to analyze and analyze the sample quality, including the determination of the sample quality, to determine the sample quality, and to prepare the sample before analysis. This study focuses on the influence of the main pretreatment methods on the quality of the products. The serum exogenous substance is added to the sample at different concentration levels, and the four kinds of different substances and purification treatments are performed. 1. Add GuCl to the list of products. (2) GuCl is added, and it is added to Shen Dian.③ Sample heating and refining.④GuCl is added and refined. In addition, the sample was analyzed by LC-MS, and the number of samples was determined. The efficiency of the prime pretreatment method was evaluated by adding the quality of the sample. The results of different treatments are as follows: The heating of the sample is the same as that of the quantitative results. The method of purification treatment is the best quantitative method, especially the method of quality control. This method is rapid and simple, and the modulation process is minimal. The above results show that the biological sample is suitable for pre-treatment, high concentration and high concentration of different agents, and the quality and concentration of different agents are suitable for pre-treatment, high concentration and high concentration of different agents. This method can be applied to clinical applications.

项目成果

ノンターゲット定量プロテオミクスにおける試料調製法の開発

非靶向定量蛋白质组学样品制备方法的开发

• 发表时间: 2019
• 作者: 瀧 健太朗;伊藤 佳世子
• 通讯作者: 伊藤 佳世子