ノンターゲット定量プロテオミクスにおける試料調製法の開発

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液体クロマトグラフ質量分析計(LC-MS)を用いたプロテオーム解析では、タンパク質の網羅的な同定と共に包括的なダイナミスを把握することが求められており、分析前の試料調製についてもその目的に即した処理方法が必要となる。本研究ではプロテオミクスの主要な前処理方法の1つであるIn-solution digestionのワークフローを見直し、特に分析結果への影響が大きいと考えられるタンパク質の変性と精製の方法について検証した。ヒト血清に外因性タンパク質を濃度段階的に添加した試料を用いて、次の4種類の変性、精製処理を行った。①グアニジン塩酸塩(GuCl)を添加、メタノール・クロロホルム沈殿。②GuClを添加、アセトン沈殿。③試料を加熱、精製は行わない。④GuClを添加、精製の代わりに試料を希釈。続いて還元・アルキル化、トリプシン消化を行い、これらの試料をLC-MSで分析し、同定されたペプチド数とタンパク質数から前処理方法の効率を、添加タンパク質由来のペプチドピークエリア値から定量性を評価した。その結果、変性処理ではGuCl添加と試料の加熱とで同定数に顕著な差は見られなかったが、後者はタンパク質の種類によって定量結果が大きく低下した。精製処理ではタンパク質沈殿法(特にメタノール・クロロホルム沈殿)は誤差やロスが生じたのに対し、試料を希釈する方法では最も良好な定量結果が得られた。この方法は迅速かつ簡便であり、さらに調製中のケラチン等のコンタミを最小限に抑えることが可能であった。以上の結果から生体試料を用いた定量プロテオミクスの前処理では、高濃度の変性剤を用いてタンパク質を変性し、続いて試料を希釈してその後に添加するプロテアーゼの活性が維持できるよう変性剤濃度を下げる方法が適していることが明らかとなった。本法は臨床スクリーニングやバイオマーカー探索等の分野でも活用することが可能である。