高温逆相HPLC蛍光法による血清中ペムブロリズマブ濃度測定法の開発

高温反相高效液相色谱荧光法测定血清派姆单抗浓度的方法的建立

• 批准号: 18H00397
• 负责人: 白神 霞
• 金额: $ 0.34万
• 依托单位: Hamamatsu University School of Medicine
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Scientists
• 财政年份: 2018
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2018 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-18H00397/
• 关键词: ペムブロリズマブ; 高温HPLC; proteinG

【研究の目的】ペムブロリズマブの血清中濃度と有害作用との関係を明らかにすること、また、血清中濃度の個人差の要因を解明することにより、患者個々に個別化された投与方法を構築することを長期的な目的とする。この目的を達成するために、高温HPLC法を用いたペムブロリズマブの血清中濃度測定法を開発することを本研究の目的としていた。【ペムブロリズマブのみをHPLC分析】測定条件として装置がSHIMADZU LabSolution、カラムがcore-shellカラム3.6μm・widepore XB-C18・15cm×2.1mm、測定波長が励起波長278nm・蛍光波長343nm、移動相がⒶポンプ0.1%TFA, 水・Ⓑポンプ0.3%TFA, イソパノール、注入量が20μ1、流速が0.5ml/min、温度が85℃とした。分析条件として移動相のⒶポンプとⒷポンプをgradient 20%→28.4%(7min)=1.2%/minとした。以上の条件で測定を行ったところ、約6分でペムブロリズマブ由来のピークを確認することができた。また、他の抗体医薬品(ニボルマブやラムシルマブ)と共に測定を行ったところ、分離が可能であることも確認できている。以上より、ペムブロリズマブ単独で測定した場合、短時間で測定が可能であることを確認できた。【proteinGによる前処理の条件を確立させる(血清をproteinG精製し、その精製物とペムブロリズマブを混合し分離できる条件を検討)】測定条件はペムブロリズマブのみを測定する時の条件と同じである。使用試薬はMono Spin ProG、Binding bufferが50mM sodium phosphate-150mM NaCl pH7.0、Washing bufferが50mM sodium phosphate-1M NaCl pH7.0、Elution bufferが100mM Glycin-HCl pH2.5および2.5%AcOHとしている。ProteinGとHPLCを用いてペムブロリズマブに由来するピークを確認することができたが、ペムブロリズマブに血清を加えた場合では、血清由来IgGのピークが出現し、ペムブロリズマブを抽出することができなかった。血清中にはペムブロリズマブに類似した構造をもつIgGが多量に存在するため、ProteinGとは異なる方法でペムブロリズマブを特異的に分離する必要がある。

[Objective] To clarify the relationship between serum concentrations and harmful effects of the drug, to clarify the main causes of individual differences in serum concentrations, and to establish long-term objectives for patient-specific individualization and delivery methods. The purpose of this study was to develop a method for determining serum concentrations. [HPLC analysis] Determination conditions: ShimaDZU LabSolution, Core-shell ratio 3.6μm·widepore XB-C18·15cm×2.1mm, excitation wavelength 278nm·wavelength 343nm, mobile phase: 0.1%TFA, water·TFA, injection volume: 20μ l, flow rate: 0.5ml/min, temperature: 85℃. Analysis conditions: gradient 20%→28.4%(7min)=1.2%/min The above conditions are determined by the number of minutes. The detection and isolation of other antibody drugs are possible. The above is a simple case, a short time to determine the possibility. [Protein G pretreatment conditions established (serum protein G purification, purification, mixing, separation conditions discussed)] Measurement conditions are the same as those for determination. Mono Spin ProG, Binding buffer = 50mM sodium phosphate-150mM NaCl pH 7.0, Washing buffer = 50mM sodium phosphate-1M NaCl pH 7.0, Elution buffer = 100mM Glycin-HCl pH 2.5 or 2.5%AcOH. ProteinG is used to confirm the origin of IgG. Sera contain similar structures and IgG in large quantities. ProteinG is a unique method of isolation.