胃ガン腹腔細胞診における腫瘍関連遺伝子定量法の構築とその意羲に関する研究

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1. 研究目的胃癌の腹腔細胞診は,進行胃癌の再発,主に腹膜播種再発を正確に予測する予後因子である。近年の治療技術の進歩(化学療法,外科治療など)に伴い,遺伝子検査法により微小の腫瘍細胞を高感度に捉えることが腹膜播種再発を知る重要なカギとなっている。本研究では腫瘍関連遺伝子として報告されているcarcinoembryonic antigen (CEA), squamous cell carcinoma (SCC), Trefoil factor (TFF1およびTFF2), Cytokeratine 19(CK19), Cytokeratine20 (CK20), fatty acid binding protein 1(FABP1),mucin 2(MUC2)mRNAを対象に,RT-nested-PCRによる定性的検出とReal time-PCRによる遺伝子定量系を構築し,その発現検出の臨床的意義を研究した。2. 方法検体(腹腔内洗浄液,腹水)から抽出したRNAを逆転写反応後,ATX,TFF1,TFF2,CK20,FABP1,MUC2の定性的検出を行った。また,CEA,SCC,CK19,CK20mRNAの遺伝子配列に設定したprimerでPCR増幅と同時に,hybridization probeとの反応を行い,Real-time PCR法(Light cycler)にて定量的検出法を構築した。3. 研究成果基礎実験として胃癌細胞株(MKN28,MKN45,MKN74,KATOIII,AZ521)を用いて,Real time-PCRによる遺伝子定量的検出法(CEA,SCC,CK19,CK20mRNA)の構築を行った。続いて,日常臨床検査として腫瘍関連遺伝子検査が実施された胃ガン症例の腹腔内洗浄液および腹水を対象に各症例の臨床経過と当遺伝子発現定量値の感度・特異度を検証した。(1) CEA mRNAの(RT-nested-PCR法)と(Real time-PCR法)の判定結果は一致率68%であった。(2) 腹膜播種再発症例においてRT-nested-PCR法による定性的検出法の感度は97%・特異度57%であった。(3) 腹膜播種再発症例においてReal-timePCR法(CEA mRNA)による定量的検出法の感度は64%・特異度86%であった。一方,Real-time PCR法による複数の腫瘍関連遺伝子(CEA,SCC,CK19,CK20mRNA)の組み合わせで判定すると,感度は74%,特異度は84%に上昇した。以上,胃癌の腹腔細胞診において,本研究の腫瘍関連遺伝子の病態生理学的意義,癌の転移に関与するその発現を解析することは有用と考えられた。本研究の成果は臨床検査への応用に向けた基礎データとして評価できる。