リポソームの電子顕微鏡を用いたウラン染色に代わる染色条件の検討

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研究目的:代替え酢酸ウラン染色法の確立及び,リポソームのネガティブ染色法における内部構造解析の確立。研究方法:(1)酢酸ウランに代わる染色剤としてリンタングステン酸,モリブデン酸アンモニウム,塩化ハフニウム等を使用し,緩衝液の種類,濃度,染色時間を変化させた際の違いを検証。(2)カコジル酸緩衝液(塩化ハフニウムの染色性を高める事を発見)で溶いた塩化ハフニウム染色液とクエン酸鉛染色液を組み合わせた電子染色法での樹脂切片の染色性を検証。研究成果:リンタングステン酸染色法・モリブデン酸アンモニウム染色法は,酢酸ウラン染色法より膜内構造が鮮明に観察されるため,multilamellar structuresの3次元的な構造観察も可能となった。染色条件は,リンタングステン酸(カコジル酸緩衝液;pH7.4,0.075M dissolution)の場合,染色濃度0.5及び1%,染色時間120秒において,モリブデン酸アンモニウム(カコジル酸緩衝液;pH7.4,0.075M dissolution)の場合,染色濃度0.5及び1%,染色時間120秒において膜内構造が最も鮮明に見られた。塩化ハフニウム染色法は,カコジル酸緩衝液に溶くことで酢酸ウラン水溶液(pH4.4)とほぼ同等のpH4.2まで上昇し染色性が高められることを発見。リボソームのネガティブ染色法では,膜構造は鮮明・膜内構造はやや不鮮明であったが,エポキシ樹脂切片では,カコジル酸緩衝液で溶いた塩化ハフニウム染色液とクエン酸鉛染色液を組み合わせる電子染色法によって,酢酸ウランを用いた電子染色法と同等の染色性を示した。(塩化ハフニウム水溶液・クエン酸鉛染色液の組み合わせでは染まらず,カコジル酸緩衝液で溶いた塩化ハフニウム染色液単染色では染色性が落ち,クエン酸鉛との組み合わせのみが最も鮮明)。現在,LRWhite樹脂切片での電子染色法及びBlock染色法での検討を行っている。尚,酢酸ウラン染色法より多くのcontaminationが発生するので,それを抑制するための対策も検証中である。