単一神経細胞への電極一体型色素注入装置の開発

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新皮質の単一神経細胞活動の樹状突起活動を高い信号雑音(S/N)比で記録することは樹状突起活動の情報を精査するのに役立つ。In vivo大脳皮質深部の神経活動は蛍光色素を使って観測することができる。ホールセルパッチクランプ法を使用した従来の色素注入方法は、ガラス電極が皮質深部の細胞に到達するまでに蛍光色素が細胞外に分散してしまう。分散された色素は、細胞周囲のバックグラウンドをあげるので、対象細胞樹状突起の蛍光強度変化を観測する時にノイズの原因になる。樹状突起活動のS/Nの良い記録のためにはこのノイズの問題を解決する必要がある。この問題は、最初に色素を含まない電極内液を電極先端に入れホールセルパッチ後色素入りの内液を電極先端に入れれば解決される。本研究ではガラス電極内側の色素を含まない電極内液を、ホールセルパッチクランプ後に極細管を使用して色素を含む電極内液と混合し、単一神経細胞のみに色素を充填する色素注入ホルダーを開発した。標本は、マウスの急性切片スライスを使用し、1次体性感覚野5層錐体細胞にパッチクランプ法を利用し(電極抵抗5-7MΩ)、蛍光色素Oregon Green BAPTA-1 (OGB-1)を充填した。開発した方法を使用し任意の蛍光色素濃度を細胞に注入できるかを見積もった。まず既知濃度(10,25,50μM)のOGB-1を含む電極内液でホールセルパッチクランプを行い細胞に色素を充填した。細胞が1発発火を起こす電流を注入し細胞体の蛍光強度変化を計測した。色素を後から電極内液に加えた場合の蛍光強度変化と既知濃度の蛍光強度変化を比較し、色素を後から電極内液に加えた場合の色素濃度制御の正確さを評価した。本方法を使用することでS/Nの高い神経活動を記録することが期待できる。また、本方法は電極内液に溶解する蛍光色素以外の薬物を単一細胞内に注入することができる可能性がある。