次世代シーケンサーを用いたトランスクリプトーム解析を効率的に行うための技術開発研究

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【目的】かつては大規模プロジェクトに限定されていたトランスクリプトーム解析は、汎用機種の登場により個人レベルで可能となった。本研究所においてもGS juniorが導入され、その成果が期待されている。ところが歴史が浅く、操作技術は現在も更新されている。そこで本申請では、1.GS juniorの使用法の確立、2.ハウスキーピング遺伝子を特異的に除去し、検出効率を改善する手法開発を試みた。【意義】申請者はGS juniorをはじめとする機器の管理運営に携わっており、将来の研究を担う大学院生や共同利用者への技術還元に直結する。また、多くの市販キットは真核生物を対象としており、さまざまな精製法を行うことにより、原核生物や母系mRNAのような特殊な構造を持つサンプルにも対応できると考えている。【結果】1.申請者が得意とする魚類の組織(オオメジロザメの腎臓)を用い、使用方法の確立を試みた。製造元のRosche社が配布している簡易プロトコールのみで、新規ユーザーに対しては情報が不十分と思われる箇所を洗い出し、十分なリード数(15万リード)を確保できる使用法を確立した。2.通常のcDNAクローニング工程におけるmRNA精製(Oligotex beads処理を1回)を行ったサンプルより得たデータの解析を行った結果、ハウスキーピング遺伝子の1種であるrRNAが全体の60%近くを占め、検出効率を大きく下げていることが明らかになった。そこで、Oligotex beadsとカラムを併用した処理を2回行うことで、rRNA数を10%程度に抑え、検出遺伝子の多様性を高めることに成功した。また、ビオチン標識オリゴDNAおよびアビジン標識磁気ビーズによる任意の遺伝子の吸着除去実験を行った結果、除去効率は遺伝子間で5～80%と開きが見られた。これは、対象遺伝子および作製する標識オリゴDNAの配列に大きく依存し、対象遺伝子ごとのさらなる調整が必要であることが明らかになった。