動物固定標本から核酸抽出を効率的に行うための技術開発研究

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<背景・目的>核酸を対象とする研究が普及する以前より、博物館や臨床等、ホルマリン固定した標本は膨大に存在する。これまで核酸を用いた研究におけるホルマリン固定試料の利用は、ホルムアルデヒドによる断片化、塩基の化学修飾、RNAやタンパクとのクロスリンクによる逆転写・PCR阻害等により敬遠されてきた。次世代シーケンサーは数百塩基長の核酸をターゲットとしており、長期固定試料からもデータの獲得が可能であることが分かってきた。この手法を応用すれば、過去にサンプリングされた、希少な生物標本からの遺伝的データを得ることが可能となる。本申請では、既に取り組みが開始されている、臨床分野でのホルマリン固定パラフィン包埋(FFPE)試料からの抽出法を応用し、主としてホルマリン固定試料からのRNA抽出法を検討する。<方法>魚類(メダカ, サケ, ドチザメ等)の組織を用い、液体窒素による凍結組織をポジティブコントロールとし、ホルマリン固定組織からの抽出物との比較を行った。固定期間の影響を評価するため、組織固定で用いられる24時間、個体の液浸標本として想定される1週間～1年程度ホルマリン固定を行い、通常のフェノール系抽出および、市販のFFPE試料からの核酸抽出キットを用い、抽出した核酸の比較を行った。抽出した核酸の品質評価は、Agilent社のBioanalyzerを用い泳動パターンの比較により行なった。<結果・考察>24時間～数日程度の固定であれば、100～200塩基長程度のRNA断片を比較的多量得ることができ、次世代シーケンシング等への有効性はあると考えられた。一方、長期間(半年～1年)固定を行った試料においても200塩基長程度のRNAは得られたものの分解が進行し、収率も低かった。また、FFPE精製キットをアレンジした精製は、大量の組織に対応しておらず、安定した抽出のためには操作のさらなる見直しが必要であった。また、ホルマリンによる抽出物への化学修飾の解消、断片化に伴うPolyA末端を用いた精製法が使用できなくなるため、今後はそれらに関しても検討する必要があると考えられる。